實驗專欄丨石蠟切片和冰凍切片——傻傻分不清楚

2021-01-21 中洪博元醫學實驗幫

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在組織實驗中，石蠟切片和冰凍切片是最常見的兩種切片方法，兩種優缺點明顯，在實驗的應用上也大有不同。而兩個實驗的相同點都是應用免疫學基本原理——即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內蛋白質，對其進行定位、定性及相對定量的研究。


有些做實驗的小夥伴們，對於石蠟切片和冰凍切片處於傻傻分不清楚，今天我們就來介紹一下兩者的實驗步驟和不同點。

組織學常規製片技術中最為廣泛應用的方法。石蠟切片不僅用於觀察正常細胞組織的形態結構，也是病理學和法醫學等學科用以研究、觀察及判斷細胞組織的形態變化的主要方法，而且也已相當廣泛地用於其他許多學科領域的研究中。


1、  固定：將新鮮組織切成小塊，固定於4%多聚甲醛過夜。凝固組織中的物質成分，儘可能保持其活體時的結構。同時能使組織硬化，有利於切片的進行。


2、脫水：為了減少組織材料的急劇收縮，應使用從低濃度到高濃度遞增的順序進行經70%、85%、95%直至純酒精（無水乙醇），每次時間為1小時。固定後的組織材料需除去留在組織內的固定液及其結晶沉澱，否則會影響後期的染色效果。


3、透明：常用的透明劑有二甲苯，二甲苯是石蠟的溶劑。純酒精不能與石蠟相溶，還需用能與酒精和石蠟相溶的溶劑，替換出組織內的酒精。材料塊在透明劑浸漬過程稱透明。

            

4、浸蠟：先把組織材料塊放在熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液浸漬1小時。

先後移入2個熔化的石蠟液中浸漬1小時左右。


5、包埋：以少許熱蠟液將其底部迅速貼附於包埋盒內上，然後置於速凍臺，讓石蠟固定。


6、切片：切片刀的銳利與否、蠟塊硬度是否適當都直接影響切片質量，可將蠟塊至於冷水中改變蠟塊硬度。通常切片厚度為3-5um，用毛筆輕託輕放在37度水浴中展片。


7、貼片與烤片：一般使用恆溫水浴鍋，溫度控制在37-40℃左右，有利於石蠟切片的展開，貼好的切片置於60℃恆溫箱內乾燥2小時，蛋白質凝固後即可染色。


8、切片脫蠟及水化：乾燥後的切片置於二甲苯中進行脫蠟，然後依次使用從高濃度到低濃度遞減的順序進行經純酒精、95%、85%、70%進行水化。


9、染色：

經典的蘇木精和伊紅：細胞核被蘇木精染成紫藍色，多數細胞質及非細胞成分被伊紅染成粉紅色。實驗操作簡單。

免疫組化：指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應。

（圖為HE染色，此圖為公司實驗圖，盜圖必究 ）

冰凍切片是一種在低溫條件下使組織快速冷凍到一定的硬度，然後進行切片的一種方法。製作過程較石蠟切片快捷、簡便，因而多應用於手術中的快速病理診斷。

一、取材：

應儘可能快地採取新鮮的材料，防止組織發生死後變化。


二、速凍：

1、將組織塊平放於軟塑瓶蓋或特製小盒內（直徑約2cm）。

2、如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織，然後將特製小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內。 

3、當盒底部接觸液氮時即開始氣化沸騰，此時小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結成塊。

4、在製成凍塊後，即可置入恆冷箱切片機冰凍切片。

5、若需要保存，應快速以鋁箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱貯存備用。


三、固定：

1、樣品託上塗一層OCT包埋膠，將速凍組織置於其上，4℃冰箱預冷5-10min讓OCT膠浸透組織。

2、取下組織置於錫箔或者玻片上，樣品託速凍。

3、組織置於樣品託上，其上再添一層OCT膠，以完全覆蓋為宜，速凍架（PE）上30min。


四，切片：

1、恆溫冰凍切片機為較理想的冰凍切片機，其基本結構是將切片機置於低溫密閉室內，故切片時不受外界溫度和環境影響，可連續切薄片至5-10μm。

2、切片時，低溫室內溫度以-15℃ ~ -20℃為宜，溫度過低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動。


五、免疫螢光染色：

1、冰凍切片室溫晾乾15min，可用含10%正常山羊血清的PBS室溫封閉切片1小時（此步可不洗）。 

2、滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液（抗體的量視組織大小而定，原則是可以均勻覆蓋組織面，且保證整個過程中不會使組織乾涸）。

3、將切片放在加了PBS的免疫組化溼盒，室溫孵育2小時或4℃過夜。

4、第二天先將溼盒放到37℃回溫1h，然後吸取片上的一抗進行回收，將切片插入到小染缸PBS衝洗。

5、滴加用PBS稀釋好的二抗（避光）置於分子雜交箱中37℃孵育1小時。回收二抗，切片置於染缸內，PBS洗5min×3次。

6、滴加DAPI工作液染核，室溫10-20min（工作濃度0.1%染色15min）。

7、回收DAPI，滴加5-10μl抗螢光衰減封片劑或中性樹膠，用處理乾淨的蓋玻片封片，即可到螢光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

8、做好的切片放在切片盒內，置於4℃冰箱，可保存一周左右。

（圖為免疫組化，此圖為公司實驗圖，盜圖必究 ）



石蠟切片

冷凍切片

應用對象

廣泛應用常規製片

手術中的快速病理診斷

保持時間

持久保存

保存時間較短

優點

1、 細胞定位準確

2、 組織細胞形態結構保存完好，

3、 保存時可放在室溫下保存


1、 簡便。

2、 快速，用時短

3、 組織變化不大

4、 能很好的保存脂肪、類脂等成分

5、 較好的保存抗原活性及酶類。

缺點

1、步驟繁多，製片中抗原活性有所降低

1、不易做連續切片

2、切取的組織不能過大

表格中就是石蠟切片和冷凍切片的對比了！各位實驗狗們，千萬不要弄混淆了

更多操作

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