在醫療領域,病理組織石蠟切片是診斷患者疾病的主要手段之一。由於病理切片製作過程中,影響病理組織石蠟切片製作質量的因素眾多。故這裡整理出病理組織石蠟切片的7個注意事項:
臨床所取標本要新鮮,否則細胞內溶酶體會破裂,造成細胞自溶。組織固定液多選用10%中性福馬林,其有效成分為甲醛,甲醛易揮發,使得福馬林的效用會越來越低,所以福馬林至好現配現用;固定液體積要超過標本的10~20倍,否則固定不充分,影響染色;固定標本的容器要以使標本不變形為宜;取材時,除嚴格按照病理標本取材操作規範外,小標本一般全取,大標本在去除不必要的組織後,要特別注意病變部位與正常組織交界處;取材切片觀察面要平整,否則組織經脫水後變韌,導致組織包埋時不能壓平於包埋盒中,切片時修整蠟塊很繁瑣。
現組織多採用程序化脫水浸蠟,所以要根據標本的多少及大小及時更換脫水機內試劑,否則會影響脫水效果,使組織與蠟不能相溶,無法製作出合格的組織蠟塊。條件允許的情況下可根據組織標本的不同選擇合適的石蠟,組織韌性大選擇高熔點石蠟,組織軟選取低熔點石蠟。包埋時,組織要充分壓平於包埋模底部,以保證組織的預期觀察切面在同一水平;先向包埋盒中灌滴少許液體石蠟,此步驟可使成型蠟塊底部光滑平整,再將組織觀察面壓平於包埋盒底部,組織擺放緊湊但不重疊。為使包埋組織的蠟塊快速凝固,一般先將浸液體蠟的包埋盒置於冷凍臺上,蠟塊在置於冷凍臺上後,應在蠟大部分或完全凝固後,再移動包埋盒;若蠟塊未完全凝固,而移動了包埋盒,成型蠟塊底部平整度相差甚遠,有的凝固蠟塊底部平整,有的蠟塊底部不平整,可致小標本在修片的過程中被浪費。
切片時常見問題及常用解決方法如下:
(1)切片橫向褶皺過多,不能成帶。原因:蠟塊溫度過高、切片刀變鈍、切片刀邊緣粘有少量石蠟。解決方法:將蠟塊重新放置冰袋或冷凍盒上,使蠟塊降溫;更換切片刀的位置,或換新的切片刀;或用水沾溼紗布,順切片刀刀口方向,輕輕擦拭切片刀。
(2)切片上有位置不定的數道小裂縫或裂紋。原因:蠟塊溫度過高、切片刀變鈍。解決方法:將蠟塊重新放置冰袋或冷凍盒上,使蠟塊降溫;更換切片刀的位置,或更換新的切片刀。
(3)切片上有位置固定的一道或幾道裂縫或裂紋。原因:切片刀有小缺口、蠟塊內有雜質或體積較小的似骨(鈣)化性較硬的組織、包埋時蠟塊不均勻凝固。解決方法:移動切片刀或更換新的切片刀;用少量鹽酸軟化硬的鈣化性組織;重新包埋蠟塊。
(4)切片厚薄不均,或是每固定幾片後,切出一張完整的片子。原因:蠟塊過硬或過大、蠟塊夾持器或切片刀鬆動、切片機微動失靈,不能調節出正確的切片厚度。解決方法:組織塊過硬可重新取材包埋,過大可重新包埋;調整機器,上緊刀片;修理機器。
(5)切出的蠟條明顯向一側彎曲變形。原因:彎曲處蠟塊質地不均,蠟塊未修整好,邊緣毛糙等、彎曲處切片刀變鈍。解決方法:重新修整蠟塊;移動切片刀;冷凍蠟塊,蠟塊質地稍變硬後也可以使彎曲變小。
漂片溫度選擇比蠟塊熔點低10℃即可。溫度過高會使蠟條產生數目不等的小氣泡。
烤片時溫度與時間的選擇範圍廣,可從37℃烤箱烤乾1天至75℃烤箱烤乾20min,可以根據不同目的需要,確定烤片時間和溫度,或是依石蠟熔點來確定,一般將溫度控制比石蠟熔點高10~15℃。
(1)組織脫蠟透明等過程採用物質分子相似相溶原理,試劑有效成分容易減少,所以脫蠟試劑要及時更換,若脫蠟不充分,會使切片染色不均勻;因乙醇、二甲苯等易揮發,故在操作完成時,應及時封蓋,溶液濃度降低會影響洗片效果;
(2)染色時,鹽酸乙醇分化步驟尤其重要,分化的目的是使胞核染色,而無背景色。明礬蘇木精性質使其在酸性溶液中呈現紅色,在鹼性溶液中呈現藍色。在鹽酸乙醇分化時,切片由深藍變為粉紅色時,應停止分化。分化時,有經驗者可以肉眼觀察切片至粉紅色時終止分化,初學者可鏡下多次觀察切片,至切片除胞核外,無其他背景著色時,停止分化;或是依據鹽酸乙醇濃度,確定分化時間,試劑初配製時,鹽酸乙醇濃度高,分化時間短,反之則分化時間延長。切片分化完成後,將切片移至弱鹼性的溶液中返藍,一般採用自來水,或是溫度在50℃的自來水中,因其本身為弱鹼性,且取用方便,所以被廣泛使用。
(1)需吹乾或烤乾切片上水分,否則鏡下觀察時有一層白霧,導致細胞輪廓不清楚;
(2)病理組織切片HE染色一般採用中性樹膠封片,封片時以無氣泡為準,否則會影響鏡下觀察:常用24mm×32mm大小的蓋玻片,只需用一次性的巴氏吸管滴二滴中性樹膠即可,過少則致封片不完全,過多則致中性樹膠外溢。
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