做石蠟切片之前,這篇文章讓你少走彎路!

（清喉嚨）

實驗課前的日常講解，

請大家放下舉起手機，

專心聽講！

（小編不間斷插播經驗總結，一定要看完哦！）

【實驗目的】
了解石蠟切片技術的基本原理和方法步驟。

【實驗原理】
採用光學顯微鏡研究一般生物體的內部結構，在自然狀態下是無法觀察清楚的，多數動、植物材料都必須經過某種處理，將組織分離成單個細胞或薄片，光線才能通過細胞。為了適應這個需要，就產生了光學顯微鏡製片技術。

光學顯微鏡的製片技術方法可分為兩大類：一類是非切片法，另一類是切片法。

非切片法，是用物理或化學的方法，使細胞彼此分離，如有分離法、塗布法、壓碎法等。非切片法的操作比較簡單，能保侍細胞的完整，但是細胞之間的正常位置往往被更動，無法反映細胞之間的正常聯繫。它可以與切片法配合使用，各取其長處。

切片法，是利用銳利的刃具將組織切成極薄的片層，材料須經過一系列特殊的處理，如固定、脫水、包埋、切片、染色等，過程十分繁複。在製作過程中，還要經過一系列的物理和化學的處理，這些處理方法可根據各種不同材料的性質要求進行合理選擇。切片法雖然工序繁瑣，技術複雜，但是，它最能保持細胞間的正常的相互關係，能較好和較長時間地保留細胞的原貌，所以仍然是光學顯微鏡的主要製片方法。

【實驗儀器、材料和試劑】

（一）儀器：石蠟切片機、恆溫蠟箱、載玻片、蓋玻片

（二）材料：你需要製片的組織材料，如洋蔥根或小鼠肝

（三）試劑：乙醚、無水乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、重鉻酸鉀、鋨酸、正丁醇、二甲苯、石蠟、甘油、雞蛋、紗布、加拿大樹膠、麝香草酚

對於切片機，小編有話講：

切片機還是進口的好

（雖然小編很貧窮愛國，穿的是回力，喝的是自來水）

推薦經典款：萊卡 RM2125RTS

至於價格嘛：

淘寶7萬+，

喀斯瑪近9萬，

萊卡廠商價格和喀斯瑪接近

（缺點：價格不親民）

國產的切片機也能替代，價格便宜很多，但是體驗度明顯不好。。。

【方法與步驟】

光學顯微鏡切片製作技術最簡單的切片法是徒手切片，但是由於組織塊往往十分柔軟，切削很困難，而且無法得到十分菲薄的切片，因此必須先用某些特殊物質滲入組織塊的內部起支持作用，並將整個組織塊包住，然後再用精密的切片機製作切片，才能獲得良好的效果。這種方法稱為包埋法，包埋的物質稱為包埋劑。

常用的包埋劑有石蠟、火棉膠、炭蠟、明膠等，水和塑料也可作為包埋劑。根據包埋劑的不同，分別有石蠟切片、火棉膠切片、冰凍切片等，它們各有長處，可以根據需要選用，但是使用得最多的還是石蠟切片技術。

石蠟作為包埋劑，有其獨特的優點：石蠟能切出極薄的蠟片（2～10μm）；切片時能連成蠟帶，便於製作連續切片；操作較容易，組織塊可以包埋在石蠟中長期保存。然而石蠟切片的製作過程較長，步驟很多，一步不慎往往導致前功盡棄，而且這些處理引起組織塊或多或少地收縮，切片時受溼度影響比較大，這些不足之處必須在製片過程中認真對待，儘量減小它的不良影響。

石蠟切片的製作過程主要包括：取材，固定，脫水，透明，透蠟，包埋，切片，貼片，染色，透明，封藏等步驟。

材料的好壞直接影響到切片的質量，無論取哪一種動植物材料，以下幾點是必須注意的。

（1）植物材料選擇時須儘可能不損傷植物體或所需要的部分；動物材料取用時常對動物施以麻醉，常用的麻醉劑有氯仿和乙醚，或將動物殺死後迅速取出所需要的組織。

（2）取材必須新鮮，這一點對於從事細胞生物學研究尤為重要，應該儘可能割取生活著的組織塊，並隨即投入固定液。

（3）切取材料時刀要銳利，避免因擠壓細胞使其受到損傷。

（4）切取的材料應該小而薄，便於固定劑迅速滲入內部。一般厚度不超過2mm，大小不超過5×5mm2。

組織和細胞離開機體後，在一定時間內仍然延續著生命活動，會引起病理變化直至歸於死亡。為了使標本能反映它生前的正常狀態，必須儘早地用某些化學藥品迅速地殺死組織和細胞，阻抑上述變化，並將結構成分轉化為不溶性物質，防止某些結構的溶化和消失。這種處理就是固定。除了上述作用外，固定劑會使組織適當硬化以便於隨後的處理，還會改變細胞內部的折射係數並使某些部分易於染色。

固定劑的作用對象主要是蛋白質，至於其他成分如脂肪和糖，在一般製作時不加考慮，如要觀察這些物質，可用特殊的方法將其固定下來。

固定劑的作用表現在對材料體積的改變、硬化的程度、穿透的速度以及對染色的影響等方面。這些作用的好壞、大小，都依所固定的材料性質而定，同樣一種固定液對某一材料來說是良好的，但對另外一些組織可能就不很適用。良好的固定劑必須具備的特徵是：穿透組織的速度快，能將細胞中的內含物凝固成不溶解物質，不使組織膨脹或收縮以保持原形，硬化組織的程度適中，增加細胞內含物的折光度，增加酶染和染色能力，具有保存劑作用。

固定劑有簡單固定劑和混合固定劑的劃分。

簡單固定劑即單一的固定劑，常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀和鋨酸。其中，苦味酸、升汞、鉻酸既能凝固細胞清蛋白，又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白，而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、餓酸和重鉻酸鉀對這兩種蛋白質都不凝固。
簡單固定劑的局限性較大，如將其適當混合，製成複合固定劑可以取得更好的效果。常用的混合固定劑有：
Bouin液（70份苦味酸飽和水溶液+25份4％甲醛+5份冰醋酸）、Zenker液（升汞5g＋重鉻酸鉀2.5g＋硫酸鈉1.0g＋5ml冰醋酸＋100ml蒸鎦水）、Carnoy改良液（3份無水乙醇+1份冰醋酸）等。固定劑的種類甚多，我們必須依據各種固定劑的性能及製片的不同要求來加以選擇。

小編有話講：

甲醛和70%酒精是常用的固定劑

如果使用甲醛固定的話，需要在梯度脫水之前流水衝洗24h，以除去甲醛的影響。

固定時，須注意以下幾點：

（1）固定劑應有足夠的量，一般為組織塊體積的10～15倍。

（2）如所固定的材料外表有不易穿透的物質，可將材料先在含乙醇的溶液中固定幾分鐘，再移入水溶性的固定液。

（3）材料固定後如不立即下沉，可將其中氣泡抽出。

（4）固定時間依材料大小、固定劑種類而異，可從1小時到幾十小時，有時中間需要更新固定劑。某些固定劑對組織的硬化作用較強，作用時間應嚴加控制，不能過長。

（5）一般固定劑都以新配製的為好，用過的不能再用。有些混合固定劑由甲、乙兩液合併者，一定要在使用前才混合。

（6）固定完畢，根據所用固定劑的不同，用水或乙醇衝掉殘留的固定劑，以免固定劑形成沉澱，影響以後組織塊的染色。

生物組織中含有大量的水分，它和石蠟是不能相溶的，致使在包埋時石蠟無法滲入組織內部，因此須使用脫水劑將水分除盡，這就是脫水的作用。

脫水劑必須能與水以任何比例相混合。脫水劑有兩類：一類是非石蠟溶劑，如乙醇、丙酮等，脫水後必須再經過透明，才能透蠟包埋；另一類是兼石蠟溶劑，如正丁醇，脫水後即可直接透蠟。

常用的脫水劑是乙醇，因為它價格便宜，易於得到。為了避免劇烈的擴散引起的組織的強烈收縮，脫水步驟應從低到高以一定的濃度梯度來進行，一般組織從30％乙醇開始，經過50％、70％、80％、95％、100％至完全脫水；對於一些柔軟的組織應從15％開始。脫水時間依據組織的類型和大小而定，一般各級乙醇中放置45min到1h，如果中間須停頓，應使材料停留在70％乙醇中，因為低濃度乙醇易使組織變軟、解體，高濃度乙醇有脆化組織作用，放置時間不能過長，另外，脫水必須在有蓋瓶中進行，以防止高濃度乙醇吸收空氣中水分導致濃度降低而使脫水不徹底。需要保存的材料可脫水至70%乙醇時停留其中，如需長期保存，可加入等量的甘油。

丙酮也是很好的脫水劑，其作用和用法與乙醇相同，不過其脫水力和收縮力都比乙醇強。
甘油常用於藻類、菌類及柔弱材料的脫水。

二氧六環為無色的石蠟溶劑，對組織沒有收縮及硬化等不良後果，但其蒸氣有毒，使用時須小心。

正丁醇可與水及乙醇混合，亦為石蠟溶劑，其優點是很少引起組織塊的收縮與變脆。
叔丁醇的性質、作用和用法同於正丁醇，但因其價格昂貴而很少使用。

小編有話講：

對於甲醛浸泡的樣本，在流水衝洗24h後，從50%酒精開始進行梯度脫水，

70%酒精浸泡的樣本，可按照80%、90%和100%的酒精濃度梯度依次脫水。

組織塊用非石蠟溶劑脫水後必須經過透明。透明劑能同時與脫水劑和石蠟混合，它取代了脫水劑後，石蠟便能順利地滲入組織。

透明劑的種類很多，較常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。
二甲苯作用較快，透明力強，但組織塊在其中停留過久，容易收縮變脆變硬，同時若脫水不淨，就會引起不良後果，在應用時必須特別小心。通常將組織塊先經純乙醇與二甲苯的等體積混合液，再進入純二甲苯，這樣可減少上述的缺點。透明時間應由組織大小而定，—般各級停留時間在30min至2h，在純二甲苯中應更換2次，總時間則以不超過3h為宜。材料經過透明，會顯示出前一步脫水的效果如何，若脫水徹底，組織則顯現透明狀態，如組織中有白色雲霧狀，說明脫水不淨，須返工處理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明時，應避免其揮發和吸收空氣中的水分，並保持其無水狀態。 

甲苯的一般性質與二甲苯相似。用法亦同，唯沸點較低，透明較慢，但不會使組織變脆。

苯的用法同於二甲苯，對組織的收縮作用小，但須警惕其爆炸和吸入而引起中毒。氯仿適於大塊組織的透明。

溫馨提示：

注意通風和遠離，

請為我保重身體！

包埋用的石蠟，熔點在50～60℃之間，應根據材料本身的硬度、切片的厚薄和當時的氣溫條件來選用。一般動物材料最常用的石蠟熔點為52～56℃，植物材料的用54～58℃的；切片薄的用58～60℃的，切片厚的則用52～54℃的；室溫10～19℃時選用52～54℃的石蠟可順利切片，冬季可用熔點46～48℃的石蠟，夏季可選56～58℃的。

石蠟的優劣與切片的成敗密切相關。

鑑別石蠟質量的方法是：將石蠟熔化後倒入紙盒使其凝結且無氣泡和裂痕，30～35℃放置24h且無氣泡和不透明的晶狀小點出現，蠟塊裂面不呈顆粒狀，切成薄片不碎成細粒。這種石蠟即為品質優良。含有雜質的新蠟或用過的廢蠟可清潔後再用，方法是將石蠟放入鍋內，加熱到開始冒白煙，然後用小火繼續加熱30min（注意別超過發火點），使其去除水分和揮發性雜質，並在溫箱中過濾以去除灰塵等顆粒。

透蠟須在恆溫箱中進行，恆溫箱的溫度調節至高於石蠟熔點3度，使經過透明的組織塊依次用石蠟與二甲苯的等量混合液、純石蠟處理。純石蠟應處理2～3次，透蠟的時間依材料性質而定，一般每次需15～30min。

透明的關鍵是控制溫度的恆定，切忌忽高忽低，溫度過低石蠟凝固無法滲透，溫度過高使組織收縮發脆。

包埋是使浸透蠟的組織塊包裹在石蠟中。具體做法是；先準備好紙盒（具體折法見圖1-3及說明），將熔蠟倒入盒內，迅速用預溫的鑷子夾取組織塊平放在紙盒底部，切面朝下，再輕輕提起紙盒，平放在冷水中，待表面石蠟凝固後立即將紙盒按入水中，使其迅速冷卻凝固，30min後取出。

包埋用蠟的溫度應略高於透蠟溫度，保證組織塊與周圍石蠟完全融為一體。石蠟的迅速冷卻也很重要，否則包埋塊中將會產生結晶。以後切片時引起碎裂。

（1）石蠟塊的固著與整修

在包埋以後，就可進行切片。包埋好的石蠟塊裝上切片機進行切片前還須進行固著和整修。
固著：一般旋轉式切片機上都附有可固著石蠟塊的金屬小盤，這也可用同樣大小的臺木替代。用加熱的蠟鏟將包埋塊粘貼於固著物上，並使組織塊朝外，便於以後迅速切出所需的片子。
整修：用加熱的蠟鏟或刀片將固著的包埋塊四周修平，使上下兩面修成平行面，常保留組織周圍附著寬2～3mm的石蠟，而修好的蠟塊呈長方形。還可削去一角以便於在蠟帶上識別切片。

（2）切片機和切片刀
切片機是用來作各種組織切片的一種專門設計的精密機械，常用的是旋轉式切片機，它的夾物部分是上下移動前後推進的，而夾刀部分則固定不動。主要部件是安裝切片刀的刀臺、安裝包埋塊的標本臺和控制切片厚度的微動裝置。切片時切片刀固定不動，轉動轉輪，標本臺上下運動並按調好的切片厚度向前推進一定的距離，組織塊上下運動一次，便在刀片上得到一張合乎厚度要求的切片。
切片刀與切片的質量直接相關。切片前必須磨刀，方法是：將切片刀裝上刀柄、刀背夾、滴少許石蠟油在平滑的磨刀石上，將刀貼著磨刀石以背向刀口方向磨，使用完畢後應及時用二甲苯將石蠟油擦淨。

（3）切片方法
切片前，將刀口置放大鏡下觀察，選擇刀口平整無缺刻的部分來進行切削。將所要切的包埋塊固定在標本臺上，使包埋塊外切面與標本夾截面平行，並讓包埋塊稍露出一截。將刀臺推至外緣後鬆開刀片夾的螺旋，上好刀片，使切片刀平面與組織切面間呈15°左右的夾角，包埋塊上下邊與刀口平行。在微動裝置上調節切片要求的厚度，調節時應注意指針不可在兩個刻度之間，否則容易損傷切片機，將刀臺移至近標本臺處，讓刀口與組織切面稍稍接觸，這時就可以開始切片了。方法是：右手轉動轉輪，左手持毛筆在刀口稍下端接隹切好的片子，並託住切下的蠟帶，待蠟帶形成一定長度後，右手停止轉動，持另一枝毛筆輕輕將蠟帶挑起，平放於襯有黑紙的紙盒內，注意切片速度不宜太快，搖動轉輪用力應均勻，防止切片機震動厲害引起切片厚薄不均勻，還應注意轉動的方向，以防標本臺後移而切不到片子。切片完畢，應及時用氯仿將切片機的有關部分擦淨。

（4）切片中存在的問題及補救方法
石蠟切片是很不容易掌握的，有時很容易成功，有時則由於某種因素而造成切片的質量低劣，甚至完全失敗。現將切片時經常遇到的一些缺點、可能的原因以及補救辦法見下。

敲黑板！

成功不常有，悲劇總發生！

石蠟切片可能產生的問題和解決方法：

問題1：石蠟帶彎曲不直
原 因：
1．石蠟塊上下兩邊不平行
2．石蠟塊的上下兩邊不和刀口平行
3．刀口鋒利不一，局部產生差異
4．蠟塊的一邊較另一邊為軟，或兩邊的硬度不一致
5．材料未居蠟塊正中央
6．材料大而形不正
補 救 辦 法 ：
1．取下臺木，將兩邊修幹
2．調節標本臺，使兩者平行
3．移動刀片，改用新的刀口
4．待蠟塊冷卻後再切，或重新包埋
5．用刀片切去部分石蠟，使材料居中
6．在大的一邊切去少許石蠟

問題2：切片分離、不能連成帶狀
原 因：
1．室溫過低
2．石蠟過硬
3．材料邊緣留蠟太少
4．刀的角度不適合
補 救 辦 法 ：
1．在切片機上方開一電燈或提高室溫
2．在蠟塊面加一層45℃的軟蠟或用手指蠟摩擦塊面
3．重新包埋
4．矯正刀的角度

問題3：切片捲起呈圓筒狀
原 因：
1．室溫過低
2．石蠟過硬
3．刀口太鈍
4．刀的傾角太大
補 救 辦 法 ：
1．提高室溫
2．加軟蠟
3用毛筆將蠟片攤開壓住，切2—3 片即成帶
4．減小傾角

問題4：切片粘附於切片刀，皺摺在一起
原 因：
1．室溫過高
2．石蠟過軟
3．刀口上留有一層石蠟
4．刀口鈍
補 救 辦 法 ：
1．降低室溫
2．將蠟塊投入涼水中稍浸耒—增加
3．切片厚度，改用硬蠟包埋，用二甲苯拭去刀口的石蠟
4．磨刀或移動刀口

問題5：切片縱裂
原 因：
1．刀有缺口
2．石蠟塊中含有顆粒、雜質
3．刀口留有碎屑或細絲
4．組織太硬
補 救 辦 法 ：
1．可移動刀口
2．將顆粒拽去
3．清潔刀口
4．讓包埋塊在水中浸泡

問題6：切片有橫紋
原 因：
1．刀和臺木的固定螺絲太松
2．刀口傾斜度太大
3．刀口有石蠟屑
補 救 辦 法 ：
1．旋緊螺旋
2．可放平1—2。後再切
3．用氯仿拭去

問題7：切片厚薄不勻
原 因：
1．切片機有毛病
2．夾刀不當
3，未旋緊標本臺螺旋
4。石蠟塊過硬
補 救 辦 法 ：
1．矯正切片機裝置
2．對症治療
3．旋緊螺旋
4．將石蠟塊在水中浸泡

問題8：每張切片厚薄不勻
原 因：
1．刀口震動，是由於材料過硬
2．刀的傾角太大
補 救 辦 法 ：
1。在蠟塊表面塗一層火棉膠
2．減小傾角

問題9：材料發生裂隙破碎或脫落
原 因：
1．脫水不乾淨
2．有透明劑殘留
3．石蠟透入時，溫度過高或時間過長
4．由於脫水劑和透明劑的影響，使組織變硬發脆
5．材料太硬或太粗
補 救 辦 法 ：
1．無法彌補
2．增加浸蠟時間，重新包埋
3．無法補救
4．用正丁醇、叔丁醇和二氧六環等進行脫水和透明
5．在蠟塊表面塗一薄層火棉膠溶液 

問題10：切片時發生沙沙聲
原 因：
1．組織塊過硬
2．包埋溫度過高
3，材料內留有結晶體
補 救 辦 法 ：
1．浸泡水中軟化
2．無法補救
3．無法補救

問題11：石蠟塊將蠟帶抬起
原 因：
1．由於摩擦而產生靜電荷所致
2．石蠟塊上面附有石蠟碎屑
3．刀口上附有石蠟碎屑
補 救 辦 法 ：
1．提高室溫
2．用刀片將碎屑清除
3．用二甲苯或氧仿清除

切好的切片必須貼附於載玻片上才能作進一步處理，但是切片常有細小的橫紋，必須經展平後才能貼附，否則影響染色和觀察。
貼片一般有撈片法和燙板法。

撈片法比較簡單，首先將切片分割開，投入到48℃的溫水浴中，這時切片都浮在水面上，由於表面張力的作用使切片自然展平，然後用塗有甘油蛋白溶液（將雞蛋一個打破入杯中，去除蛋黃留下蛋白，用筷子充分調打成雪花狀泡沫，然後用雙層紗布過濾至容器中，加入等量的甘油，混合，最後加入百分之一體積的麝香草酚（thymol）作防腐用，可保存幾個月到一年。）或5％明膠水溶液的載玻片傾斜著插入水面去撈取切片，使切片貼附在載玻片的合適位置，於室溫下放置一晝夜後使其徹底乾燥。

燙板法，是將塗有粘片劑的載玻片上塗上水，把已分割好的切片貼上去，再置載玻片於35℃恆定的燙板上讓切片攤幹，並傾斜或用吸水紙吸去水分，最後將載玻片再度放燙板上晾乾。
要注意，不管是使用撈片法還是燙板法，所用的載玻片必須潔淨，不能有油汙（檢驗法：已塗有粘片劑的載玻片上滴加數滴蒸餾水，若發現水不均勻分散而聚成滴狀，即表示載玻片不清潔，有殘留油脂等物在上面）；切片的光面應朝下，否則染色過程中切片容易脫落。

小編有話講：

實際操作中，最簡單的撈片方法是水浴沸騰後冷卻到46度左右，再用片子去撈切片。注意：片子一定要乾淨，如果是做病理的專用載玻片肯定最佳。

洗片子的方法，可以用洗衣粉洗或者用硫酸洗液浸泡，注意衝洗乾淨，再過幾遍蒸餾水，用40%的酒精保存即可，一般可保存數月。有的實驗室在用之前會用明膠掛片。

組織切片是無色透明的，必須進行染色後才能觀察到各種微細結構。染色方法很多，但是染色劑往往是水溶液，因此切片必須經過脫蠟而再度復水。這方法即為脫水、透明的逆過程。由於切片十分菲薄，處理的時間大大減少，一般每級停留約2～5min。

染色是一個複雜的過程，兼有物理和化學作用，對其中的機制目前了解得不很清楚。研究細胞器和細胞內的重要組分都有很多現成的方法，例如顯示DNA的Feulgen反應，顯示RNA的Brachet反應，顯示多糖的PAS反應，顯示蛋白質的Millon反應和顯示某些酶的鈣—鈷法等，可以根據不同的要求來選用。

染色後的切片須再次經過脫水、透明。標本經二甲苯透明後，折射率改變，透明度提高，使得染上色的部位更清晰地顯示出來。

封藏的目的是使製成的切片能夠永久保存，封藏劑必須能與透明劑互溶，對染色無影響，折射率近似玻璃和具有粘性的物質，常用的封藏劑有加拿大樹膠和中性樹膠。

封片的方法是：將載玻片從二甲苯中吸出後，吸去多餘的二甲苯，在標本上的二甲苯尚未乾透之前加一滴樹膠，仔細覆蓋上蓋玻片，避免產生氣泡，也不得拖動蓋玻片，以免將標本破壞。樹膠量視蓋玻片大小而定，勿使過多過少。

貼上標籤，註明材料、染色法，待封藏劑凝固後便成為一張成功的石蠟切片。

恭喜你已經get到做石蠟切片的正確姿勢！

磨刀不誤砍材工，

現在可以霍霍向組織了！

以上內容整理自：細胞生物學實驗教程(王金髮 何炎明 主編 科學出版社）和血淚經驗總結