免疫螢光雙標技術中7大操作要點和兩大注意事項

　　

　　一、免疫螢光的標本製作的基本程序同DAB顯色的免疫組化，不同點如下：

　　1. 免疫螢光不需要使用雙氧水處理，封閉和一抗孵育與其它相同。

　　2. 免疫螢光的二抗使用不同螢光標記的二抗孵育，孵育時間根據抗體的工作濃度確定。

　　3. 二抗孵育之後充分洗片後即可貼片、封片和觀察。

　　4. 免疫螢光在封片使用專用封片劑或甘油：0.01MPBS (1：1)。

　　5. 條件許可可以購買防淬滅的試劑加入封片劑中，標本可以保存更久。

　　6. 螢光抗體的孵育以及後續處理需要閉光。

　　7. 螢光抗體染色假陽性可能會多，需要設定陽性和陰性對照。

　　二、注意事項

　　1. 螢光染色後一般在1h內完成觀察，或於4℃保存4h，時間過長，會使螢光減弱。

　　2. 每次試驗時，需設置以下三種對照：

　　(1) 陽性對照：陽性血清+螢光標記物

　　(2) 陰性對照：陰性血清+螢光標記物

　　(3) 螢光標記物對照：PBS+螢光標記物

　　三、免疫螢光雙標的經驗之談

　　1. 選取primary antibodies時要來源於兩種不同的動物，用來源於rabbit和rat的抗體，secondary antibodies則是不同螢光信號標記的，用donkey anti-rabbit-FITC(綠)和donkey anti-rat-Tex-Red(紅)。

　　2. 我的做法是兩種primary antibodies同時孵育，然後兩種secondary antibodies同時孵育。抗體濃度、孵育時間要認真摸索，感覺primary antibodies 4度孵育過夜比較好，背景比較乾淨。

　　3. 我的陽性對照採用的是陽性組織切片，陰性對照則分別是rabitt和rat的IgG，螢光標記物對照是PBS+螢光標記物。

　　4. Block用的血清使secondary antibody來源動物的血清，我的是10%正常donkey血清。

　　5. 其餘同一般操作。

 

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