Western blot的原理、操作和注意事項

Western blot的原理

通過電泳區分不同的組分，並轉移至固相支持物，通過特異性試劑（抗體）作為探針，對靶物質進行檢測，蛋白質的Western印跡技術結合了凝膠電泳的高解析度和固相免疫測定的特異敏感等多種特點，可檢測到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。

一、抗原的選擇和製備

A：樣品的製備

1 組織：  

組織的處理方法：組織洗滌後加入3倍體積預冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超聲波破碎，5000rpm，5mins 離心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚藍（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分裝後於-20℃保存，用時取出，直接溶解上樣。

2 細胞：

細胞的處理方法： 離心收集細胞或者直接往細胞培養瓶內加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超聲波破碎，5000rpm，5mins 離心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚藍（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分裝後於-20℃保存，用時取出，直接溶解上樣。

3 分泌蛋白的提取（特例）：

直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚藍制樣。

B：蛋白的定量方法及影響蛋白定量原因

1.雙縮脲法：

雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質濃度的方法。在需要快速，但不很準確的測定中，常用此法。硫銨不幹擾顯色，這對蛋白質提純的早期階段是非常有利的。雙縮脲法的原理是Cu2+與蛋白質的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡合，形成紫藍色絡合物，此物在540nm波長處有最大吸收。雙縮脲法常用於0.5g/L～10g/L含量的蛋白質溶液測定。幹擾物有硫醇，以及具有肽性質緩衝液，如Tris、Good緩衝液等。可用沉澱法除去幹擾物，即用等體積10%冷的三氯醋酸沉澱蛋白質，然後棄去上清液，再用已知體積的1m NaOH溶解沉澱的蛋白質進行定量測定。

2.Lowry法：

此法是雙縮脲法的進一步發展。他的第一步就是雙縮脲反應，即Cu++與蛋白質在鹼性溶液中形成絡合物，然後這個絡合物還原磷鉬磷-磷鎢酸試劑（福林-酚試劑），結果得到深藍色物。此法比雙縮脲法靈敏得多，適合於測定20mg/L～400mg/L含量的蛋白質溶液。其幹擾物質與雙縮脲法相同，而且受他們的影響更大，硫醇和許多其他物質的存在會使結果嚴重偏差。另外要注意的是，加入福林試劑時要特別小心，試劑只在酸性pH環境中才穩定，上述提到的還原反應只有在pH10時才發生，因此，福林試劑加入到鹼性的Cu2+-蛋白質溶液中時，必須立刻攪拌，以使磷鉬酸-磷鎢酸試劑在未被破壞之前能有效地被Cu2+-蛋白質絡合物所還原。

3.紫外吸收法：

大多數蛋白質在280nm波長處有特徵的最大吸收，這是由於蛋白質中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的緣故，因此，利用這個特異性吸收，可以計算蛋白質的含量。如果沒有幹擾物質的存在，在280nm處的吸收可用於測定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白質溶液。部分純化的蛋白質常含有核酸，核酸在260nm波長處有最大吸收。有核酸時，所測得的蛋白質濃度必須作適當校正，一般按下述公式粗略計算：

  這一公式是減去溶液中非蛋白質成分產生的誤差。但是，蛋白質之間的分子量差異比較大，因此，在比較幾種蛋白質含量時，必須作適當的校正。由於蛋白質的吸收峰常因pH改變而變化，所以在製作標準曲線時，必須與樣品條件一致。

4. Bradford比色法：

Bradford比色法比Lowry法測定蛋白濃度更簡單迅速。用脫氧膽酸/三氯乙酸沉澱蛋白可排除甘油、去汙劑、2-巰基乙醇、乙酸、硫酸銨、Tris和一些鹼性緩衝系統的幹擾。

分別在兩組微量離心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白（5，10，15和20µl），以0.15mmol/lNaCl補足至100µl，同時以兩管100µl的0.15mmol/l NaCl作空白對照。每管各加入1ml考馬斯亮藍染料溶液，振蕩混勻，室溫放置2分鐘。用1cm光徑的微量比色杯測A595，取A595吸光值對標準蛋白濃度作圖，畫標準曲線，並測量待測樣品的A595。從BSA標準曲線中確定待測樣品的濃度。測定10-100µg的蛋白質，要在較大試管中將染料溶液體積增大5倍進行。樣品濃度過高，可稀釋後進行，或在10-100µg另作一標準曲線進行測定。

5．電泳估算法（我們選擇此法）：

樣品倍比稀釋，SDS-PAGE電泳，同時做定量marker對照，可以估算樣品大概濃度。

以提取癌組織總蛋白為例：

① 取等量胰腺癌組織、癌旁組織及正常胰腺組織，用dH2O漂洗5～10次，再用預冷的1×PBS洗滌3次，目的是去除樣本中的血液。

② 每2克組織加入3ml 1×PBS勻漿，保持在4℃條件進行。

③ 加入5×STOP Buffer緩衝液1ml，混勻，4℃下超聲碎化。再加入0.5ml β-ME，0.5ml溴酚藍，煮沸10mins，至此，制樣過程完成；

④ SDS-PAGE電泳，以BAS作為對照估計樣品蛋白濃度。

二、SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE）

A：實際操作

1.  做膠前的準備

1)檢查是否有足夠的、乾淨的spacer、comb 和架子。

2)檢查是否有新鮮的，足量10%APS（過硫酸銨，輔助催化劑），沒有立刻重配。

3)按將要檢測的抗體對應的原始抗原的分子量大小，計算出膠的濃度，並算出分離膠各組分的用量。

2.  制膠，電泳

1）裝好架子。

2)按照下面配方配製分離膠。(單位：ml，Total： 8ml)

     7.5％

     10％

      15%

2×Sep.  buffer

      4

      4  

4

30％ Gel.sol

     2.0

     2.7

4

   ddH2O

     1.9

     1.2

0

  TEMED

     8ul

     8ul

      8ul

  10%APS

     80ul

     80ul

      80ul

在膠上面加入一層蒸餾水，促進膠更好的凝集。

3)待分離膠凝集後，配製濃縮膠。(單位：ml，Total： 3.5ml)

     3％

2×Stacking.  buffer

     1.7

30％ Gel.sol

     0.35

    ddH2O

     1.4

   TEMED

     5ul

   10%APS

     50ul

倒好後插入預先準備好的梳子。

4)待膠凝集好後，上樣，電泳。 上層膠用60-80V電壓，當樣品至分離膠時，用100-120V電壓。一般電泳時間在1.5小時左右。

B ：注意事項及常遇到的問題

1）分離膠不要倒的太滿，需要有一定的濃縮膠空間，否則起不到濃縮效果。

2）上樣蛋白量不應超過30ug/mm2(載荷面即：如果你的膠槽是5mm×1mm，則載荷面為：1mm×5mm=5mm2) 。

  3）gel通常在0.5-1h內凝集最好，過快表示TEMED、APS用量過多，此時膠太硬易龜裂，而且電泳時容易燒膠。太慢則說明兩種試劑用量不夠或者系統實際不純或實效。

  4）混合攪拌速度太快產生氣泡影響聚合，導致電泳帶畸形。太慢不均勻，特別是甘油。

  5）電泳中常出現的一些現象：

  ︶ 條帶呈笑臉狀，原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。

︵ 條帶呈皺眉狀，可能是由於裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。

拖尾：樣品溶解不好。

紋理（縱向條紋）：樣品中含有不溶性顆粒。

條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜。

條帶兩邊擴散：加樣量過多。

三、轉移

在電流的作用下，使蛋白質從膠轉移至固相載體（膜）上。

膜的選擇：印跡中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF等。我們選用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理強度，以及具有更好的化學兼容性。有兩種規格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2um   for MW<20kDa)。

A 半乾法

即將凝膠夾層組合放在吸有轉印緩衝液的濾紙之間，通過濾紙上吸附的緩衝液傳導電流，起到轉移的效果。因為電流直接作用在膜膠上，所以其轉移條件比較嚴酷，但是其轉移時間短，效率高。

1 實驗條件的選擇

電流1mA-2mA/cm2，我們通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、膠濃度選擇轉移時間，具體可以根據實際適當調整。

目的蛋白分子大小(kDa)

膠濃度

轉移時間(h)

80---140

8%

1.5-2.0

25---80

10

1.5

15--40

12

0.75

<20

15

0.5

2 實驗操作

     （1）濾紙和膜的準備 (在電泳結束前20分鐘應開始準備工作)。

A.  檢查是否有足夠的transferbuffer，沒有立即配製。

B.  檢查是否有合適大小的濾紙和膜。

C.  將膜泡入甲醇中，約1-2分鐘。再轉入transfer buffer中。

D.  將合適的靠膠濾紙和靠膜濾紙分別泡入transfer buffer 中。

  （2）轉移

A.     在電轉移儀上鋪好下層濾紙。一般用三層。

B.     將膜鋪在靠膜濾紙上，注意和濾紙間不要有氣泡，再倒一些transfer buffer到膜上，保持膜的溼潤。

C.     將膠剝出，去掉stackgel，小心的移到膜上。

D.     剪去膜的左上角，在膜上用鉛筆標記出膠的位置。

E.     將一張靠膠濾紙覆蓋在膠上。 倒上些transfer buffer，再鋪兩張靠膠濾紙。

F.     裝好電轉移儀，根據需要選定所需的電流和時間。

G.     轉移過程中要隨時觀察電壓的變化，如有異常應及時調整。

3 注意事項及常遇到的問題

1）濾紙、膠、膜之間的大小，一般是濾紙>=膜>=膠。

2）濾紙、膠、膜之間千萬不能有氣泡，氣泡會造成短路。

3）因為膜的疏水性，膜必須首先在甲醇中完全浸溼。而且在以後的操作中，膜也必須隨時保持溼潤（幹膜法除外）。

4）濾紙可以重複利用，上層濾紙（靠膜）內吸附有很多轉移透過的蛋白質，所以上下濾紙一定不能弄混，在不能分辨的情況下，可以將靠膠濾紙換新的。

5）轉移時間一般為1.5 小時，( 1mA-2mA/cm2，10% gel)，可根據分子量大小調整轉移時間和電流大小。

 

B 溼法

我們基本上不用此方法，這裡暫不做介紹。

C 轉移後效果的鑑定

1．染膠

用考馬斯亮蘭染色經destain脫色後，看膠上是否還有蛋白來反映轉移的效果。

2．染膜

有兩類染液選擇，可逆的和不可逆的。可逆的有ponceau-s red、Fastgreen FC、CPTS等，這類染料染色後，色素可以被洗掉，膜可以用做進一步的分析用。但是不可逆的染料，如考馬斯亮蘭、india ink、Amido.black 10B等，染色後膜就不能用於進一步的分析。

四、封閉（block）

    封閉是為了使我們的抗體僅僅只能跟特異的蛋白質結合而不是和膜結合。

常用的封閉液有bovineserum albumin(BSA)，non-fat milk，casein，gelatin，tween-20等，我們一般用non-fat milk。

在轉移結束前配好5%的Milk(TBST溶解)。轉移結束後將膜放入milk中block(一定要放在乾淨的容器裡，避免汙染而且要足以覆蓋膜)，並清洗整理好用過的濾紙，以便下次使用。 Block 4°C O/N，或 RT 1小時。

五、一抗孵育

A.    先將需要檢測的抗體準備好，並決定好它們的稀釋度。

B.    配好5%的Milk(TBST溶解)，按要求稀釋好抗體。注意，如需高比例稀釋，最好採用梯度稀釋。

C.    將稀釋好的抗體和膜一起孵育。 一般採用RT 1小時，可根據抗體量和膜上抗原量適當延長或縮短時間。

注意：為了便於後面分析結果，我們一般會選用已確定分子量大小而且純度高的抗體作為marker與一抗同時孵育。

 

六、洗滌

用 TBST（tris+tween等）先快速洗三次，把milk儘快的wash掉。然後5mins *5。洗滌是為了洗去一抗與抗原的非特異性結合，洗滌的效果直接影響結果背景的深淺。

 

七、孵育二抗

孵育 RT1 小時。一般採用HRP標記的二抗，稀釋比例為1:5000。

二抗的稀釋比例不能太低，否則容易導致非特異性的結合。

注意二抗的選擇有多種，要根據一抗來選擇抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗，以及根據後面的顯色條件來選擇HRP、AP或者GOD（葡萄糖氧化酶）酶鏈的二抗或者標誌其他探針（如核素等）的。

 

八、洗滌

用 TBST先快速洗三次，把milk儘快的wash掉。 然後5mins *5。

洗滌是為了洗去二抗的非特異性結合，洗滌的效果直接影響結果背景的深淺，所以洗滌一定要乾淨。

 

九、顯色（HRP酶）

1．增強化學發光法(ECL)

Ecl 顯色原理：氨基苯二醯肼類主要是魯米諾及異魯米諾衍生物，是最常用的一類化學發光劑。魯米諾（luminol，5＇-氨基-2，3-二氫-1，4-酞嗪二酮）的分子結構及化學反應式如下：

　　魯米諾在免疫測定中既可用作標記物，也可用作過氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和魯米諾，在HRP（辣根過氧化物酶）的作用下，發出螢光來。

試驗步驟：

1）將兩種顯色底物1：1等體積混合（一般各1ml/membrane）。

2）將混合物覆蓋在膜表面，1-2分鐘，搖晃使均勻。

3）用保鮮膜把膜包起來，放入夾板中。

4）在暗室中將X光片，覆蓋在膜的上面，夾好夾子，曝光1min。

5）顯影、定影。

6）根據結果調整曝光時間和曝光區域，得到最佳結果。

注意：螢光在一段時間後會越來越弱。

2.DAB顯色

DAB（3,3二氨基聯苯胺）和HRP反應產生棕色的不溶終產物。這種棕色沉澱不溶於酒精和其它有機溶劑，對於必需使用傳統復染和封固介質的免疫組化染色應用特別理想。

對於AP標記的二抗我們選用BCIPand NBT 顯色，它們在鹼性磷酸酶（AP）作用下反應可生成一種不溶性黑紫色沉澱的強信號。

 

十、分析結果及其判斷

   常見問題原因分析及處理方法： 見以後文章

 

附錄一：試驗中所用到的試劑和緩衝溶液

1)  5x Stop Solution (Sample buffer) pH6.7:

Stock:             to use:

20% Glycerol  100ml      take 9.5ml stock       

10% SDS 50g or 250ml 20% SDS  add BME 0.5ml

250mM Tris   15.14g     bromphenol blue or

    total   475.00ml    pyronine 4 to taste

2) Gel solution (30% w/vacrylamide mix):

0.8bis-acrylamide          0.8g

29.2% acrylamide           29.2g

     total             100ml

3) 2x Laemmli Separation Buffer:        

0.75M Tris-HCl            90.825g

0.2% SDS               10ml 20% SDS

    total              1000ml

   pH8.8    

4) 2x Laemmli StackingBuffer:

0.25M Tris              15.14g

0.2% SDS               1g

    total              500ml

    pH6.8

5) 10x Laemmli RunningBuffer:

250mM Tris              60.55g

1.9M Glycine             285.27g

1% SDS                20g

  total                2 liters

  pH8.3

6) Transfer Buffer:

48mM Tris base             5.81g

39mM Glycine               2.93g

0.037% SDS                0.375g

20% MeOH                 200ml

total                 1000ml

7) TBST:

10mM Tris-HCl，      1.21g

100mM                NaCl

0.2%                 Tween-20

 Total                1000ml

 pH7.4

8)  Coomassie Stain :

40%MeOH                400ml

10%HAc                 100ml

0.1%BBR                1g Brilliant Blue R

 total                1000ml

9)  Destain:

  30%MeOH               300ml

 7.5%HAc                75ml

  total                1000ml

10) 10×麗春紅染液配方：

   麗春紅               2g

   磺基水楊酸             30g

   三氯醋酸              30g

total                 100ml

11）DAB

   DAB                 50mg

   0.05mol/L TB （PH7.6） 100ml

   30%H2O2              30-40ul

先配成2-5倍的儲存液，過濾後分裝，-20℃避光保存，H2O2在工作液中終濃度0.01％。

 

實驗需要反覆摸索，找到最佳反應條件。

(圖片來源於網絡)