ELISA實驗的原理+操作步驟+注意事項 | 實驗專區

ELISA 是酶聯接免疫吸附劑測定 ( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay ) 的簡稱。它是繼免疫螢光 和放射免疫技術之後發展起來的一種免疫酶技術。 此項技術自 70 年代初問世以來， 發展十分迅速， 目前已被廣泛用於生物學和醫學科學的許多領域。

ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。

由於抗原、抗體的反應在一種固相載體 ──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育後，可通過洗滌除去多餘的游離反應物，從而保證試驗結果的特異性與穩定性。

在實際應用中，通過不同的設計，具體的方法步驟可有多種。即 :用於檢測抗體的間接法、用於檢測抗原的雙抗體夾心法以及用於檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是 ELISA 雙抗體夾心法及 ELISA 間接法。

方法一 用於檢測未知抗原的雙抗體夾心法 :

1. 包被： 用 0.05M PH9.  牰碳酸鹽包被緩衝液將抗體稀釋至蛋白質含量為 1 ～10μ ／ml 。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加 0.1ml ，4℃  過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩衝液洗  3 次，每次 3 分鐘。 ( 簡稱洗滌，下同 ) 。

2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品 0.1ml  於上述已包被之反應孔中，置 37 ℃ 孵育 1 小時。然後洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔 ) 。

3. 加酶標抗體： 於各反應孔中， 加入新鮮稀釋的酶標抗體 (經滴定後的稀釋度 )0.1ml 。37℃ 孵 育 0.5 ～1 小時，洗滌。

4. 加底物液顯色：於各反應孔中加入臨時配製的 TMB 底物溶液 0.1ml，37℃ 10 ～30 分鐘。

5. 終止反應：於各反應孔中加入 2M 硫 酸 0.05ml 。

6. 結果判定：可於白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺， 以「+」、「-」號表示。也可測 OD  值：在 ELISA  檢測儀上，於 450nm(  若以 ABTS 顯色，則 410nm)  處，以空白對照孔調零後測各孔 OD 值，若大於規定的陰性對照 OD 值 的 2.1 倍，即為陽性。

方法二 用於檢測未知抗體的間接法：

用包被緩衝液將已知抗原稀釋至 1 ～10μ ／ml ， 每孔加  0.1ml ，4℃過夜。次日洗滌 3 次 。

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加一定稀釋的待檢樣品 (未知抗體 )0.1ml  於上述已包被之反應孔中,置 37 ℃孵育  1 小時 ,洗滌。 (同時做空白、陰性及陽性孔對照 )

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於反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體 (抗抗體 )0.1ml ，

37 ℃孵育 30-60  分鐘，洗滌 ,最後一遍用 DDW 洗滌。

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其餘步驟同「雙抗體夾心法」的 4 、5、6 。

1. 試劑：

(1) 包被緩衝液 (PH9.6 0.05M 碳酸鹽緩衝液 ): 

  NaHCO３   1.59 克

  NaHCO３   2.93 克

  加蒸餾水至 1000ml

(2) 洗滌緩衝液 (PH7.4 PBS) ： 0.15M 

  KH 2PO4    0.2  克

  Na2HPO４·12H 2O    2.9 克

  NaCl    8.0 克

  KCl    0.2 克

  Tween-20   0.05％   0.5ml

  加蒸餾水至1000ml

(3) 稀釋液：

  牛血清白蛋白 (BSA) 0.1 克加洗滌緩衝液至 100ml

  或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成 5 ～ 10 ％使用。

(4) 終止液 (2M H ２SO ４）：

  蒸餾水 178.3ml ，逐滴加入濃硫酸 (98 ％)21.7ml 。

(5) 底物緩衝液(PH5.0 磷酸棗檸檬酸)：

  0.2M Na２HPO ４(28.4 克 ／ L)  25.7ml

  0.1M 檸檬酸 (19.2  克／ L)   24.3ml

  加蒸餾水50ml 

(6) TMB( 四 甲 基 聯 苯 胺 ) 使 用 液 : 

  TMB(10mg／5ml 無水乙醇 ) 0.5ml 

  底物緩衝液 (PH5.5) 10ml

  0.75 ％H２O２   32μ1

(7) ABTS 使 用 液 :

  ABTS    0.5mg

  底物緩衝液 (PH5.5)    1ml 

  3％H２O２    2μ1

(8) 抗原、抗體和酶標記抗體。

(9) 正常人血清和陽性對照血清。

2. 器材：

(1)聚苯乙烯塑料板 (簡稱酶標板 )40 孔或 96 孔，ELISA 檢測儀，50μ及100μ 加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。

(2) 小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。

(3) 4 ℃冰箱，37 ℃孵育箱。

1. 正式試驗時，應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應，可採用羊血清、兔血清或 BSA 等封閉。

2. 在 ELISA 中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括 :

  (1) 固相載體的選擇：許多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙醯胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是 40 孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據此判明其吸附性能是否良好。

  (2) 包被抗體 ( 或抗原 )的選擇：將抗體 (或抗原 )吸附在固相載體表面時，要求純度要好 ,吸附時一般要求 PH 在 9.0 ～9.6 之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響 ,一般多採用 4 ℃ 18 ～24 小時。蛋白質包被的最適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度 (0.1 、1.0  和 10μ   ／ml  等)進行包被後，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的 OD 值。選擇 OD 值最大而蛋白量最少的濃度。對於多數蛋白質來說通常為1 ～10μ ／ml 。

  (3) 酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接 ELISA 法進行初步效價的滴定 (見酶標記抗體部份 ) 。然後再固定其它條件或採取 「方陣法 」包被物、 待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度 ) 在正式實驗系統裡準確地滴定其工作濃度。

  (4) 酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體 (如OPD 等)有潛在的致癌作用， 應注意防護。 有條件者應使用不致癌、 靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間後，應加入強酸或強鹼以終止反應。通常底物作用時間，以 10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配製，尤其是 H 2O2 在臨用前加入。