Western Blot定量——面積法

2021-02-08 Paper繪圖

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背景介紹

  蛋白質印跡法（免疫印跡試驗）即Western Blot。它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況的信息。

  蛋白質印跡法是由瑞士米歇爾弗雷德裡希生物研究所的Harry Towbin在1979年提出的。在尼爾·伯奈特於1981年所著的《分析生物化學》中首次被稱為Western Blot。蛋白免疫印跡是將電泳分離後的細胞或組織中蛋白質從凝膠轉移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然後用特異性抗體檢測某特定抗原的一種蛋白質檢測技術，現已廣泛應用於基因在蛋白水平的表達研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個方面。（——來自《百度百科》）

  今天我們主要來講一下，蛋白條帶中蛋白表達的半定量分析，也就是將蛋白條帶進行數值化。這裡又涉及到一個知識，就是什麼是半定量分析，隨手百度一下：

  也就是說，將蛋白的真正的含量，通過拍照轉換為一定的灰度值，使用軟體測量其數值，這個過程就屬於半定量分析。

軟體

ImageJ 或者FIJI


(公眾號回覆：ImageJ或FIJI即可獲取軟體，公眾號菜單欄即可獲得安裝和使用教程)

圖文介紹

1.雙擊打開ImageJ軟體

2.打開軟體自帶的凝膠圖片，用這個來做演示

3.首先，我們將圖片調整為8bit

4.然後調節一下對比度，點擊Auto即可，然後點擊應用。調整對比度的主要目的還是使得圖片中顏色的區分度更明顯一點

5.接下來我們來標記蛋白條帶，使用矩形工具框柱蛋白即可

6.然後選擇Analyze-Gels-Plot lanes(Ctrl+3),即可出現一條曲線

7.使用直線工具對其封口

8.使用魔棒工具進行封口，直線一定要和曲線相交，不然魔棒選中的就是一片

9.最終就會出現一組數值

10.最終將重複做的實驗結果進行分析，就可以獲得平行數據，進行作圖即可。好啦，今天的教程你學會了嗎？趕緊來試試吧！

心之所向，必能達成！

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    ，編輯了這份 western blot 操作步驟，內容包括主要操作步驟和所需要注意的有用的細節，並附上參考文獻。樣品建議分裝成合適的量（比如分裝出 20 ul 檢測蛋白質定量用），然後於 -20℃ 或 -80℃ 中長期保存，但要注意不要反覆凍融，因為會使蛋白的抗原特性發生改變。若蛋白提取過程存在問題或蛋白發生降解則很難進行好之後的實驗，也就很難做出好的結果了。
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    ，說法各異，於是綜合了目前網上所能找到的資料和個人實際經驗，編輯了這份 western blot 操作步驟，內容包括主要操作步驟和所需要注意的有用的細節，並附上參考文獻。我按下文的步驟操作已經做出來了穩定可重複的、背景乾淨的 western 條帶了，所以相信你也行。為了節省時間，我總結了一下 western blot Quick Guide和一天做出 western 的具體時間規劃，附在文末，要在下一次展示。
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