Southern Blot Flow
一 基因組酶切和電泳
在200 μl 微量離心管中加入：
25 μl DNA樣品(約10μg)，
3μl 限制性內切酶（MBI，10 U/ μl）
5 μl 相應的10×buffer，
補水到50μl。
然後加一滴礦物油覆蓋, 稍微離心後放於37℃水浴8-12小時。酶切完後，取5μl 酶切DNA樣品於0.8%的瓊脂糖凝膠上檢測酶是否充分。如果酶切充分，灌制0.8%的agrose膠，加入上樣buffer後，在25—30V穩壓電泳12—16hrs。
注意：在southern雜交中對，DNA的質量要求較高，否則酶切不完全導致失敗。
二 轉膜
1 用0.2MHCl 脫嘌呤處理，偶爾輕輕振蕩至溴酚藍完全變成黃色，大約需要15~30分鐘。然後用水漂洗凝膠2~3次，將水倒盡，加入鹼變性液，偶爾輕輕振蕩至溴酚藍完全恢復到原來的藍色（大約需要20~30分鐘）。
注意：此方法對酶切後目標片段大於15kb時用，如果小於15kb最好不要進行脫嘌呤處理，否則容易將片段打斷，導致轉膜後結合不緊密。
2 取一磁碟架上一洗淨玻璃板，在磁碟中倒入適量的轉膜緩衝液，在玻璃板上架兩層長濾紙（30cm左右）（注意不要產生氣泡）搭成鹽橋。（濾紙比膠弱寬）依膠大小裁好尼龍膜，寫好標記，正面向下，緊貼於膠上，防止有氣泡產生，接這壓兩張同樣大小的濾紙，不可過大以免短路，膠周圍用X光片壓條。膠應反面朝上因為DNA多在膠的底層。堆積吸水紙。上面放一小玻板，板上加一500 g左右的重物。
注意：防止短路
3 轉膜16---20hrs後，將尼龍膜取下，膠染色，觀察轉膜效果。將膜用2xSSC浸泡20分鐘，濾紙吸乾後放在烘箱中烘2hrs（80℃）。待用。
三 雜交
¨ 雜交爐與雜交管預熱至65℃
¨ 尼龍膜用2×SSC浸泡
配置雜交液
ssDNA沸水變性10min，冰浴10min，置冰浴備用
Components Volume (ml) Note
ddH2O 20.7
50×Denhardts 0.6
P/H stock 8.1
20% SDS (OR 10% SDS) 0.3 (OR 0.6)
Total 30 ml for 2 blots. 65℃預熱.
Add prepared ssDNA （10mg/L） ≥0.3 ml
倒入雜交液，加入尼龍膜，65℃預雜交4~5小時（新膜）
注意：趕盡膜與膜之間的氣泡後把幾張膜同時放入雜交管，並用玻棒趕盡膜與管壁之間的氣泡，最後加入雜交液，蓋好管蓋。
四 探針標記
（for1~2 blots）
ddH2O 7 ml
Marker 1.5 ml
模板DNA 2 ml (about 100 ng)
沸水變性8min，冰浴10min，瞬時離心
Add Buffer+Primer 7.5 ml
Add dNTPs(-dCTP) 3 ml
Add Klenow (about 1.5U) 1 ml (2U/ml)
瞬時離心
Add 32p-dCTP 1~2 ml (10~20 uCi per blot)
37℃ 水浴≥4小時
五 雜交
向標記探針的離心管中
Add 等體積TE 25 ml
Add 10×體積變性劑（雜交液） 250 ml
沸水變性10min，冰浴10min，將變性好的探針加入到雜交液中，混勻，65℃雜交過夜（12~16小時）。
六 洗膜
1. 2×SSC,0.5%SDS 5min
2. 0.1×SSC,0.1%SDS xmin (RT)
3. 0.1×SSC,0.1%SDS χmin (65℃)
(洗膜過程中不斷檢測放射性強度直至200~500)
濾紙吸乾洗液，保鮮膜包好，暗室中壓片，根據放射性強度暴光若干天。
衝洗X光片。
說明：
由於做southern的整個過程比較複雜涉及到的試劑也比較多，我這裡僅做了個簡要的敘述，但基本的實驗過程已列舉出來了，此過程中的試劑可以根據具體的實驗要求適當調整，如果各位有那裡不清楚或者那些部分需要具體的介紹，請與我聯繫，我們共同討論學習，另外，做雜交的過程中一定要注意防止同位素洩漏，做好個人的防護工作。 |