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hi,大家好呀，我是瓜瓜~
今天給大家分享RNA幹擾實驗技術教程，希望能夠對大家有幫助~
為了方便大家閱讀，先奉上目錄思維導圖
01 RNA幹擾技術背景知識
通過生化和遺傳學研究表明，RNA幹擾包括起始階段和效應階段。
在起始階段：加入的小分子RNA被切割為21~23個核苷酸長的小分子幹擾RNA片段（small interfering RNA，siRNA）。證據表明：一個稱為Dicer的酶是RNA酶Ⅲ家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種依賴ATP的方式逐步切割由外源導入或者由轉基因、病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，將其降解為19~21bp的雙鏈RNA（siRNA），每個片段的3』端都有2個鹼基突出。
在RNAi效應階段：siRNA雙鏈結合一個核酶複合物從而形成所謂RNA誘導沉默複合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。激活RISC需要一個依賴ATP的將小分子RNA解雙鏈的過程。激活的RISC通過鹼基配對定位到同源mRNA轉錄本上，並在距離siRNA3'端12個鹼基的位置切割mRNA。儘管切割的確切機制尚不明了，但每個RISC都包含一個siRNA和一個不同於Dicer 的 RNA酶。
siRNA製備方法：目前為止較為常用的製備siRNA的方法有化學合成、體外轉錄、長片段dsRNA經RNA酶Ⅲ類降解（如Dicer，E.coli 的RNA酶Ⅲ）體外製備siRNA，以及通過siRNA表達載體或者病毒載體、PCR製備的siRNA表達框在細胞中表達產生siRNA。
方法分析：前面的3種方法主要都是體外製備siRNA，並且需要專門的RNA轉染試劑將siRNA轉到細胞內。而採用siRNA表達載體和基於PCR的表達框架則屬於從轉染到細胞的DNA模板中在體內轉錄得到siRNA。這兩種方法的優點在於不需要直接操作RNA。
轉染方法：將製備好的siRNA、siRNA表達載體或表達框架轉染至真核細胞中的方法主要有以下幾種：磷酸鈣共沉澱、電穿孔法、DEAE-葡聚糖和1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物（polybrene）、機械法[如顯微注射和基因槍（biolistic particle）]和陽離子脂質體介導的轉染。
PS：下文將介紹用siRNA表達框架製備siRNA，並用陽離子脂質體轉染細胞的實驗方法。
03 實驗用品
材料：指數生長期的細胞。
試劑：siRNA表達框架的PCR模板、上遊引物、dNTP混合液、Tag DNA聚合酶、10×PCR反應緩衝液、Lipofectamine2000、細胞生長培養基、無血清培養基、0.25%胰蛋白酶、3mol/L CH3COONa（pH5.2）、無水乙醇、70%乙醇、TE（pH8.0）。
設備：PCR儀、細胞培養箱、恆溫水浴箱、冷凍離心機、紫外分光光度計、顯微鏡、35mm細胞培養皿、微量移液器（20ul）、0.2ml和1.5ml聚苯乙烯Eppendorf管（滅菌）、槍頭（滅菌）。
04 試劑配製
上遊引物：濃度20umol/L。
dNTP混合液：將dATP、dGTP、dCTP和dTTP鈉鹽各100mg合併，加去離子水2ml溶解，用0.1mol/LNaOH調節pH至7.0~7.5，使其濃度為5mmol/L，分裝後-20℃保存。現也有商品化的混合液（各2mmol/L）供應。
Tag DNA聚合酶：5U/ul，使用時其在50ul反應體積終濃度為1～2.5U。
10×PCR反應緩衝液：500mmol/LKCl，100mmol/L Tris-HCl（pH8.4），15mmol/LMgCl2。
10×D-Hanks緩衝液：NaCl80.0g，Na2 HPO4·2H2O0.6g，KCl4.0g，KH2PO40.6g，三蒸水加至1000ml，高壓滅菌後4℃保存。用時按比例稀釋。
細胞生長培養基（RPMI-1640生長培養基）：RPMI-1640基礎培養基添加10%小牛血清。
TE ：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0。
3mol/L CH3COONa（pH 5.2）：800ml H2O溶解408.3gCH3COONa，用冰醋酸調節pH至5.0，用H2O定容至1L，高壓蒸汽滅菌。
05 實驗操作步驟
001 siRNA的設計（RNAi目標序列的選取原則）
從轉錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找「AA」二聯序列，並記下其3'端的19個鹼基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結果顯示（G+C）含量在45%~55%左右的siRNA要比那些（G+C）含量偏高的更為有效。
建議在設計siRNA時不要針對5'和3』端的非編碼區（UTR），原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區域，而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始複合物可能會影響 siRNP核酸內切酶複合物結合mRNA，從而影響siRNA的效果。
將潛在的序列和相應的基因組資料庫（人、小鼠、大鼠等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（www.ncbi.nlm.nih/gov/BLAST）。
選出合適的目標序列設計並分別合成正義RNA和反義RNA的下遊引物，合成濃度20umol/L。通常一個基因需要設計多個靶序列的siRNA，併合成相應的引物，以找到最有效的siRNA序列。
002 PCR反應
向一個Eppendorf管中加入10×PCR緩衝液5u1，5mmol/LdNTP混合液2u1，上遊引物1.5u1，下遊引物（S）1.5u1，模板DNA1μ1，Tag DNA聚合酶1μ1，滅菌去離子水補足50u1；另一個Eppendorf管中加入10×PCR緩衝液5ul，5mmol/LdNTP混合液2u1，上遊引物1.5u1，下遊引物（AS）1.5u1，模板DNA1u1，Tag DNA聚合酶1μ1，滅菌去離子水補足50u1。
在PCR儀上進行兩步擴增反應：94℃，變性30s；72℃，90s，35個循環。
003 PCR產物的純化
004 轉染
轉染前準備：轉染前一天，0.25%胰蛋白酶消化細胞並計數，以5×104個細胞/平皿的密度將細胞平鋪於35mm細胞培養皿上，使其在轉染日密度不低於70%。加3ml含血清、不含抗生素的生長培養基，於含5%~7%CO2的37℃培養箱內孵育20～24h。
稀釋：在一個聚苯乙烯試管內用100ul無血清培養基稀釋1.0~2.0ugPCR產物。
混合：在另一個聚苯乙烯試管內用100ul無血清培養基稀釋2~5ulLipofectamine2000試劑。Lipofectamine2000稀釋後，在30min內同稀釋的PCR產物混合。保溫時間過長會降低活性。
室溫孵育：混合稀釋的PCR產物和稀釋的Lipofectamine2000，混勻後在室溫下孵育20min。
洗滌與孵育：孵育DNA-脂質體溶液時，用無血清培養基將要轉染的細胞洗滌3次，然後向平皿中加入0.5ml無血清培養基，將組織培養皿再放入含5%~7%CO2的37℃培養箱內孵育。
混勻：直接將複合物加入到平皿中，搖動平皿，輕輕混勻。
培養箱孵育：將平皿放在含5%~7%CO2的37℃培養箱內孵育24~48h，無需去掉複合物或更換培養基，或者在4～5h後更換生長培養基也不會降低轉染活性。
在細胞中加入複合物24~72h後，分析細胞抽提物或進行原位細胞染色，檢測報告基因活性。（這依賴於細胞類型和啟動子活性。）對穩定表達，在開始轉染1d後將細胞傳代至新鮮培養基中，2d後加入篩選抗生素。進行穩定表達需要數天或數周。
06 注意事項
001 要設立陰性對照
002 避免RNA酶汙染
003 健康的細胞培養物和嚴格的操作確保轉染的重複性
004 避免使用抗生素
005 通過合適的陽性對照優化轉染和檢測條件
006 通過標記siRNA來優化實驗
07 實驗結果及分析
結語
希望瓜瓜的分析能夠對大家的實驗有幫助~
日後還會分享更多實驗技術，歡迎大家關注我哦！
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試驗教程 | RNA提取
教程丨流式細胞儀檢測細胞周期與凋亡技術
教程 丨細胞克隆形成實驗
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