提取總RNA
1）裂解細胞
平皿上的細胞：去掉培養基，用PBS洗兩次，加入1ML Trizol，用槍頭吹下細胞轉至EP管中，靜置裂解5min；組織：加入少量液氮研磨，加入1ML Trizol，轉致EP管中，靜置裂解5min，13000rpm離心，取上清；（組織勻漿器：將組織剪成小塊與1ML Trizol一併加入到勻漿機中，研磨至無組織塊後放置2-3min，13000rpm離心，取上清）2）萃取除雜
加入0.2ML 氯仿，vortex 30s，靜置3min，4℃，13000 rpm離心10min，小心吸取上清轉至新的EP管中（上層為RNA，中層和下層含有DNA和蛋白）3）沉澱RNA
加入等體積異丙醇，翻轉顛倒6-10次，靜置10min（-20℃或者-80℃放置30min以上效果更好），4℃，13000 rpm離心10min，去上清4）洗滌
用0.5ML75%的乙醇洗兩遍，4℃，12000 rpm離心5min，風乾加入20-100ul 無RNA酶的水溶解RNA。
（這裡按照3.5mm平皿添加試劑舉例，其它平皿按照比例增減。提取RNA還有CTAB、SDS法等，並且有很多公司以這幾種方法為基礎開發出RNA柱式提取方法，多數是裂解液裡帶有蛋白變性劑和DNA酶，其它原理基本一致）
逆轉錄cDNA
逆轉錄步驟通常公司說明書自帶，通常含有oligo(dT)、dNTPs、RNA inhibitor、病毒逆轉錄酶和buffer（現在部分公司逆轉錄試劑包含了去除基因組DNA的酶在buffer裡，但部分沒有因為影響體系或消化新合成的cDNA，那就需要在逆轉錄之前先加DNase I 自己消化去除。那麼DNA汙染對於qPCR有沒有影響呢？對於80%的引物和反應條件是有影響的，這部分引物在這個反應條件下會以DNA為模板進行擴增，CT值會改變，溶解曲線也會異常。這樣的反應對於引物和反應條件的要求太高，對於引物不是太了解的老師，還是老老實實地去DNA吧。小編用過幾家公司的逆轉錄試劑，諾維贊和promega是明確有的，沒有的公司就不列出了，可以私小編詢）配置qPCR體系
PCR反應體系成分，H2O、 模板（CDNA）、引物、dNTPs、Taq DNA polymerase、Mg2+、ROX等吸光反應劑、反應buffer）（為了減少操作次數，降低誤差，公司通常將紅色字體部分合成一個或兩個溶液MIX）預配法（組內誤差小）：將3個平行的孔樣品計算3.5個體積先預先配好，再加到樣孔裡。目前很多老師都用的方法，但建議用下面方法。交叉加樣法（組間誤差小）：分別配成引物體系和樣品體系，再分別加到樣孔裡。比如有A、B兩個樣品，pri1、pri2 、pri3三對引物預配法是直接根據樣品x引物=6，預配6個3.5體積的體系，然後加到副孔中。交叉加樣法，兩個樣品，每個樣品分別要加到9個孔裡，分別預配1份含有9.5體積的樣品A和B的母液體系，將除了水之外的成分都加進去；3種引物，分別要加到6個孔裡，分別預配1份含有6.5體積的引物體系，將水加到引物體系裡；然後加到副孔中。95℃,30s; 95℃,10s; 60-65℃,10s, melt 為了增加特異性可以適當提高紅色的退火溫度。
結果處理
目前常用的結果處理方法2-ΔΔCT
推導方法：PCR 擴增是指數擴增，假設擴增效率為100%，每一段原始模板擴增產物的量為 2 的 ct （cycle times）次方
由，PCR 產物量 = 2∧ct * 起始模板量
得，
起始模板量 = PCR 產物量／2∧ct = PCR 產物量 * 2∧ - ct
待檢基因起始模板量 = PCR 產物量A * 2∧ - ct（待檢基因）
內參基因起始模板量 = PCR 產物量B * 2∧ - ct（內參基因）
PCR 產物量A=PCR 產物量B (插圖說明)
由上面三個式子，可得
對照組中：待檢基因起始模板量／內參基因起始模板量 = 2∧-【ct（待檢基因）-ct（內參基因）】= 2∧-Δct
實驗組中：待檢基因起始模板量／內參基因起始模板量 = 2∧-【ct（待檢基因）-ct（內參基因）】= 2∧-Δct
最終可以得出，實驗組／對照組=2-ΔΔCT
計算實例：
常見問題
藍箭頭，曲線下滑
黑框，無S型曲線特徵
藍圈，Ct值偏大（如Ct值＞30）
1）模板量低或基因表達豐度低，建議增加模板量觀察Ct值能否成相應倍數減少2）反應條件不適宜（如退火溫度過高）或引物設計不當（如Tm值太低）導致擴增效率低3）產物過長，建議用三步法程序擴增或通過優化引物，產物長度不宜大於300bp4）體系中可能存在抑制劑影響酶的活性，建議梯度稀釋模板或重新製備純度更高的模板紅圈，擴增曲線無法達到平臺期
基因豐度低、循環數較少，建議增加循環數或選擇適合低豐度基因定量的產品有熔解曲線，無擴增曲線
可能是擴增程序設置錯誤，未進行螢光信號搜集，建議重新實驗，增加擴增程序中延伸階段螢光信號的搜集。復孔重複性差
1）加樣誤差，改用精準的移液器，擴大反應體系、正反向引物提前混合或用預混法配體系。2）模板量低，建議提高模板量，使Ct值落在15-30之間。熔解曲線異常熔解曲線常用來判斷qPCR結果的特異性，理想的熔解曲線為單峰，異常的熔解曲線會出現雜峰、雙峰、寬峰等可能的情況，下面我們來逐一分析。熔解曲線出現雙峰
可能存在引物二聚體,建議降低引物濃度或重新設計引物等方式優化。如果有多餘的孔，建議以不加模板的PCR體系做陰性檢測，如果檢測孔中無擴增曲線，只有溶解曲線，則引物二聚體，建議更換引物。①引物特異性過差導致非特異性產物擴增，建議Blast檢查引物特異性或重新設計引物。②基因組DNA汙染。如果有多餘的孔，建議以未逆轉錄的RNA做陰性檢測，如果檢測孔中有擴增曲線和溶解曲線，則基因組DNA汙染。熔解曲線單峰但不尖銳
可能存在大小相近的非特異性產物，建議進行高解析度瓊脂糖電泳確認，很麻煩建議直接換引物。如果你是個認真細緻的同學，qPCR只需要按照步驟一步步做下去就行了。但是運氣差點呢？想要對qPCR實驗了解透徹，需要熟悉引物設計、PCR反應原理、RNA性質以及逆轉錄反應原理，甚至了解buffer裡含有的成分，從提RNA開始清楚每一個溶液的作用，甚至孵育時間、離心轉速和離心時間。