定量實時聚合酶鏈反應（qPCR）廣泛用於特異性核酸的檢測，RNA轉錄物豐度的測量和高通量實驗結果的驗證。qPCR通常在標準的96孔板上進行，現在實驗室裡的qPCR就像移液器和燒杯那樣常見。
qPCR的基本步驟
在引物設計和功能分析方面，NCBI裡的數據已經很多了。但這些數據只是理論上的，在具體實驗操作中還要經過各種複雜的計算和實驗。在以前的qPCR中，為了使測定正常進行，通常需要進行大量耗時的反覆試驗。
而現在，這些步驟都可以通過數據預實驗來完成。更方便的是，已經有人把qPCR實驗中所用到的各種工具都整合到了一個工具箱裡。比如，Biosearch (http://www.qpcrdesign.com/oligo-toolbox) 這個網站裡，就有一個成套的qPCR工具箱Oligo Toolbox，其中包含的工具能做很多實驗計算工作。
Oligo Toolbox中有什麼：
OligoSpec™ Calculator可以確定引物或探針的特定物理性質，比如可能擁有的5'，3'或內部修飾，甚至還有螢光團、黑洞淬滅基團標記、生物素標籤或修飾鹼基。如果科研人員知道序列但是不知道分子量（MW），這個計算器也能派上用場，它還能把單位從「克」換算成「摩爾」。此外，該工具還提供了260 nm處寡聚物的消光係數，可與濃度計算器一起定量濃度。
這個qPCR反應估計器可以用於計算小瓶引物或探針實際上會持續多長時間。當然……是理論上，也可以來預估引物的數量。輸入一些關於反應條件的基本信息，以找出寡核苷酸可能執行的反應次數。不過一些液體會因為移液而丟失，所以實際的反應次數會少於預估值。
Oligo Resuspension Calculator
這個有用的小工具能用來計算水或TE緩衝液的確切體積來重懸浮新加入的寡核苷酸。一些寡核苷酸廠家提供的說明書裡只會教你怎麼在乾粉引物裡加稀釋劑來配100 μM的濃度。但缺點也很明顯，限制太大了，如果要準備不同濃度引物，那就需要這個計算器來幫你。由於多次凍融循環會促進寡聚體降解，因此可以考慮將您的寡核苷酸分裝成一系列工作濃度的等分試樣。
Oligo Dilution Calculator
類似上面的工具，也是一個非常簡單明了的計算器。對於數學苦手來說，qPCR中的那些多任務計算實在是有心無力，有了這個後日子就好過多了。只要輸入寡核苷酸的濃度、所需的最終濃度和體積和ta-da，它就能算出所需稀釋劑的體積。稀釋計算器還有一個有用的功能是貼心的提供了不同的單位，再也不用擔心單位從皮摩爾轉換到微摩爾的時候點錯小數點了。
引物濃度很重要，但對於一管子未知的引物，要計算濃度可不這麼簡單。這個工具能在輸入260nm的光密度（在實驗室用分光光度計測量）或OligoSpec™ Calculator算出的消光係數，就能算出引物濃度，這是基於每個修改和基礎綜合值的估計。
當然消光係數260（ε260）用公式也能求，就是比較煩。ε260 = [(所有鹼基的ε260之和) + (所有修飾的ε260)] x 0.9，所有的ε260值都以M-1•cm-1為單位。其中，dA (ε260=15,200)，dC(ε260=7,050)，dG(ε260=12,010)，T(ε260=8400)。
這個工具可以說是Oligo Toolbox裡最大的特色。這對於設計多重qPCR實驗特別有用，其需要用特定螢光團（染料）標記的多個探針來檢測多個qPCR產物。基本上，不同螢光團不能在相同的波長下發射激發。
該光譜疊加工具顯示每種可用螢光團和淬滅劑的吸收和發射光譜，允許用戶識別任何重疊。該工具還考慮了染料與正在使用的qPCR系統（涵蓋大多數製造商）的兼容性，因此可以為儀器找到最佳的螢光團和淬滅劑組。
除了工具箱之外，在這個網站上，還能找到其他qPCR設計軟體和一系列不斷更新的資源，包括參考論文以及所有與qPCR相關的視頻和連結，安利一個。