乾貨| qPCR 實驗中關於 CT 值問題的詳細攻略,請查收!

qPCR 實驗在分析 CT時常常遇到這幾類問題，比如：

復孔間重複性差，是否都和操作有關？

無模板陰性對照出現CT值時，目的基因的CT值是否還能用？

CT值很大該怎麼辦？

今天就給大家分享下，在 qPCR 實驗中遇到關於CT值的常見問題時該如何解決。

復孔間重複性差怎麼辦？

復孔間重複性差一般會有以下兩種情況：

（1）CT值很大，如CT≥ 30，重複性差屬於正常現象。該現象符合泊松分布，即在有效模板量很少的情況下，模板與引物的碰撞存在隨機性，直接導致復孔間的CT值差異較大。

解決方法：如果融解曲線沒有雜峰，無模板陰性對照同目的基因的 CT值為 3 or 5 以上，那CT值為準確的，可多設置幾個復孔，選擇重複性好的CT值參與計算。

（2）CT＜30，重複性較差。這種情況一般同操作有關。

解決辦法：從以下幾個方面進行問題的排查： 加樣準確度； 移液器吸取液體的準確度； 定期校準 qPCR 儀。

加樣準確度

避免小體積加樣，減少加樣誤差。可以將引物、SYBR Green Mix、ddH2O配置成混合體系，並且增加模板的稀釋梯度，大體積加樣。如：原液 cDNA 添加 1 μL，可以更改為原液 cDNA 稀釋 5 倍，添加 5 μL，使用ddH2O補齊體系至 20 μL 即可。

SYBR Green Mix、配置的混合體系需要混合均勻。從 -20 ℃ 冰箱拿出的試劑需要完全融化並上下顛倒徹底混勻；配置體系時，將混在一起的 Mix 用移液器吹打混勻。

移液器吸取液體的準確度

移液器量程定期校準，校準周期為 1 年。

購買與移液器配套的槍頭，若槍頭與移液器不匹配，在吸取液體時易出現漏氣的現象，導致吸取量程不準確。

在吸取相同量程的液體體積時，注意觀察每次吸取液體在槍頭內的液面高度是否一致。

定期校準 qPCR 儀

一般 qPCR 儀校準周期為一年。

NTC（無模板陰性對照）出現CT值，目的基因的CT值還能使用嗎？

NTC（無模板陰性對照）出現擴增一般會有兩種情況：

（1）通過觀察融解曲線，NTC 與目的基因融解曲線峰形不重疊。一般 NTC 的 Tm 值較目的基因 Tm 值小。

這種情況下，NTC 的CT值是由引物二聚體造成的，並不影響目的基因CT值的採集。

（2）NTC 與目的基因融解曲線峰形重疊。NTC 的 Tm 值等於目的基因的 Tm 值。

這種情況下，說明體系已被氣溶膠汙染了。那麼，體系被汙染，目的基因的CT值還能正常使用嗎？

需要計算目的基因的CT值與 NTC 的CT值的差值（CT）來判定。

若 CT≥ 5，說明氣溶膠帶來的汙染對體系影響非常小，可以忽略不計。

如果達不到 CT≥ 5 的程度，CT≥ 3 也可以認為氣溶膠的汙染程度很低，目的基因的CT值可正常使用。

若 CT＜ 3，說明汙染已經很嚴重了，目的基因的CT值是不能使用的。

CT值很大怎麼辦？

造成CT值偏大的因素較多，主要分為以下兩大類情況：

（1）相同體系，前期實驗CT值正常，本次實驗，所有基因擴增CT值皆偏大。

這種情況下，需要排查 RNA 是否存在降解。如何判定 RNA 是否存在降解呢？可通過 1% 的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

完整度好的 RNA 是有三條帶的，以真核生物為例，三條帶分別是 28s、18s、5s，且 28s 條帶的亮度是 18s 的兩倍，5s 最暗（下圖左）。

如果 RNA 發生降解，會出現三條帶的亮度發生變化，甚至不存在完整的三條帶。如果 28s 幾乎看不到了，整個泳道 Smear 嚴重，說明 RNA 的降解已經很嚴重了，此時 RNA 不建議用作後續的逆轉錄實驗（下圖右）。重新提取 RNA 重複實驗。

（2）該基因第一次擴增，其CT值偏大，而其餘基因的CT值正常。

這種情況下就需要判定是因為基因的擴增效率低導致的CT值偏大，還是基因本身的表達量低造成的CT值偏大。

如何判定是因為基因的擴增效率低導致的CT值偏大，還是基因本身的表達量低造成的CT值偏大呢？首先需要計算引物的擴增效率。

可將基因的擴增產物進行梯度稀釋（至少三個梯度，且梯度之間的 CT均一，防止因為操作原因導致標準曲線線性關係差，進而影響擴增效率的計算），同時進行 qPCR。將得到的標準曲線進行引物擴增效率的計算。

關於引物擴增效率的計算，可參考下面的案例：

qPCR 擴增：

將 qPCR 產物進行原液、1/10、1/100 梯度稀釋，每個梯度設置三個復孔，進行 qPCR 擴增，復孔間CT值取平均值，得到三組CT值。

標準曲線繪製及擴增效率計算：

可以在 excel 上進行擴增效率的計算。稀釋梯度可以設置為 -1、-2、-3，每個梯度對應的 CT 值分別為 23.69、27.04、30.27，如下圖，進行標準曲線繪製。

通過標準曲線可以得到線性方程（y = -3.29 x + 20.42）與R2值（R2= 0.9999）。將線性方程得到的斜率（-3.29）帶入擴增效率計算公式中：，即可得到擴增效率：101.35%。

只有當擴增效率滿足 90~120%，且標準曲線R2≥ 0.99，引物的擴增效率才是合格的，定量出來的CT值才可以用來計算。且擴增效率越接近 100%，引物的擴增性能越優。

若擴增效率不滿足 90~120%，那CT值偏大是因為擴增效率不達標導致的，需要重新設計引物。

若引物的擴增效率滿足 90~120% 前提下，CT值仍然很大，則是基因本身表達量低造成的 CT值偏大，可以提高模板的添加量，但最根本的方法是改為探針法進行定量。探針法的靈敏度是高於染料法的。