【康旭小課堂】qPCR檢測原理及臨床應用

2021-01-14 康旭醫學檢驗所


各位看官好！我們上個月新增加了一個檢測項目：CV006 qPCR Pro，今天小編就結合qPCR檢測知識，和大家詳細談談為什麼要增加CV006。


qPCR即Real-time PCR，是第二代的PCR產品。與第一代產品相比，可以實現實時定量；與第三代產品相比，經濟實惠；因此，在臨床分子檢驗中應用最為廣泛。

qPCR定量是一種實時定量分析方法，最常用的有SYBR Green染料法和TaqMan探針法。兩者雖然原理不同，但是都能通過螢光信號強度變化反應DNA量的變化。

第三代PCR，即數字PCR，採用的是與qPCR完全不同的終點定量方式。由一個PCR體系，分散行成上萬個油包水的小液滴，每個小液滴行成一個相對封閉的PCR體系。通過這種方法，提高了低豐度靶基因在體系內的相對濃度，從而達到更高的檢測靈敏度。

根據每個反應管內螢光信號達到設定閾值所經歷的循環數的不同，即Ct值的變化，對起始模板量進行評估。

由於染料法沒有選擇特異性，需要做溶解曲線判斷是否有目的條帶的非特異性擴增。如果像上圖一樣產生兩個溶解曲線峰，則表示有非特異性擴增，這樣的定量結果是不準確的。只有僅出現一個溶解曲線峰時，實驗數據才能被使用。

康旭的CV003 qPCR，可用於檢測基因外顯子是否發生缺失、重複等變異。待檢測基因區段有相應MLPA試劑盒時，可優先選擇MLPA法；沒有MLPA試劑盒，可選擇qPCR進行檢測。

每個樣本做三次重複試驗，Ct值取平均值。利用2的-ΔΔct次方，計算待測區段的相對表達量。上圖檢測報告中，利用先證者與姐姐EFCC8基因4號外顯子部分區域，與對照樣本的相對表達量接近0，即發生了純合缺失變異。

現在，重點來了。為什麼會有CV003和CV006兩款產品呢？因為基因的外顯子大小不一。如MECP2三個外顯子大小分別為151bp，351bp和1217bp。qPCR的單次擴增產物<300bp，以1217bp的外顯子為例，若選擇CV003 qPCR檢測項目，我們會在該外顯子上選擇最合適的區域設計引物，進行一次qPCR檢測。通過該段區域（<300bp）實驗樣本與對照樣本的相對表達量，判斷外顯子是否有缺失、重複等；若選擇CV006 qPCR Pro，則會對整個外顯子區域，設計多對引物，進行多次qPCR檢測，一般情況下能保證該外顯子的所有鹼基序列都被檢測到。


以上就是qPCR原理及康旭新增檢測項目CV006的介紹。關於臨床分子遺傳檢測的疑問可以留言聯繫小編。在康旭小課堂上，我們會針對各位醫生的疑問，進行不定期的分享，歡迎持續關注。


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