TaqMan探針法因其良好的特異性以及可多重檢測而受到實驗人員的青睞，其實除了探針法外，還有很多好的實驗方法也被實驗人員廣泛認可，這次就介紹一下另一個應用廣泛的方法：SYBR Green染料法，它又是因為哪些優點獲得實驗人員的青睞呢？
染料法一般使用的是SYBR Green I染料，這是一種可以與雙鏈DNA小溝結合的螢光染料，其不會與單鏈DNA結合，且在游離狀態下幾乎無螢光，只有與雙鏈DNA結合才會發出螢光，因此將PCR擴增產生的雙鏈DNA數量與螢光強度直接關聯，產生實時監測的效果。
☑ 通用性好，適合進行大多數類型的定量反應，可以進行熔解曲線的分析。
☑ 無需設計探針，引物設計相對簡單，不用考慮基團選擇，易於上手；成本低，無需合成探針。
☑ 無需PCR後處理，減少分析工作量並節省材料成本。
SYBR Green染料法也有其缺點，SYBR Green染料法一個反應只能檢測一個基因，無法進行二重甚至多重的實驗。同樣的相對於TaqMan探針法其特異性較差，當引物存在二聚體或者非特異性擴增時，染料同樣可以結合併發出螢光，影響定量結果。因此對於SYBR Green染料法而言，設計一套好用的引物是重中之重。
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我們需要對設計的引物擴增效果進行分析，使用陽性模板進行擴增，確定擴增產物為單一條帶，且大小符合設計預期，如有條件可以對擴增產物進行測序，保證準確性。當引物無問題後，進行反應條件的探索，對退火溫度進行溫度梯度檢測，找到合適的退火溫度，即PCR擴增效果最好，陰性模板無擴增，條帶單一，熔解曲線單峰等。
▲ 圖1：Azure Cielo™ qPCR系統12列溫度梯度設置
註：多溫度梯度設置，快速優化條件，確定合適退火溫度
設計好引物並探索好實驗條件後，對樣本進行一次預實驗，預實驗將樣本進行梯度稀釋用以製作標準曲線，分析內參基因以及目的基因的擴增效率是否接近且在100%左右，其次可確認高濃度模板中是否有抑制劑幹擾，從而確定實驗時合適的模板濃度（樣本是否需要稀釋或濃縮）。
當我們完成了實驗條件和預實驗後就可以進行正式實驗了，每個樣品都需要3個或以上的重複，保證結果的準確性。
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☑ 數據可靠性
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