詳談螢光定量PCR(一)——qPCR的原理及應用

2021-01-17 科儀嘉欣

qPCR的英文全名是Real-timeQuantitative PCR Detecting System。即實時螢光定量核酸擴增檢測系統，也叫實時定量基因擴增螢光檢測系統，簡稱qPCR。

上世紀八十年代Cetus Corporation公司的化學家Kary Mullis發明了PCR，如今DNA擴增技術儼然已經成為了生物學研究的基礎。三十多年以來，人們為了解決研究中出現的新問題新需求，不斷對這一經典技術進行改良。從經典PCR、實時定量PCR再到現在的數字PCR，PCR技術在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。如今PCR技術早已走出實驗室，在遺傳學鑑定和疾病診斷中發揮著巨大的作用，在越來越廣闊的領域裡煥發著新的活力。

終點PCR是最原始、最簡單的PCR方法，如今仍在被我們廣泛使用。使用者只能在PCR反應結束之後，通過凝膠電泳、毛細管電泳等方法對產物進行檢測。終點PCR本身是無法定量的，因為該反應產出的DNA量不一定能反映最初情況。舉例來說，不同樣品和序列的擴增效率是有差異的。

 

PCR的反應過程：

傳統PCR電泳結果：

（圖片來源於網絡）

因此，研究者們克服了PCR定量分析的挑戰——實時定量PCR（qPCR）。qPCR主要是利用插入性染料或螢光探針（比如TaqMan），人們可以通過監控PCR過程中的螢光強度比較多個樣品的DNA水平。

在qPCR中使用插入性DNA染料，隨著PCR循環的連續進行，這種染料的螢光強度會不斷增強，從而可以使人們對反應中的DNA進行定量。利用螢光信號的變化，實時監測PCR擴增反應中的每一個循環擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。

qPCR的特點

·靈敏度高

·特異性強

·全封閉PCR過程，無需後續處理

·及時反饋擴增過程，摒棄重點數據，更適用於定量

·定量範圍寬，可達10個數量級，無需稀釋樣品

·可實現一管多檢

·儀器自動分析，更快獲得結果

 

 

qPCR的原理

·什麼是Ct值？

PCR擴增過程中，擴增產物的螢光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環次數。

·Ct值的重現性

Ct值的特點：相同模板進行96次擴增，終點處產物量不恆定；Ct值則極具重現性。

 

簡單來說，模板DNA量越多，螢光達到閾值的循環次數越少，即Ct值越小；Log濃度與循環數呈線性關係，通過已知拷貝數的標準品可做出標準曲線，根據樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量。

qPCR定量分析，有絕對定量和相對定量兩種。

·絕對定量：精確計算初始反應的模板濃度（DNA/RNA）

——病毒DNA或RNA的拷貝數

——轉基因的拷貝數

·相對定量：計算初始反應模板的相對含量

——差異表達分析

——晶片評估

——轉基因生物的檢測

——基因型檢測

 

qPCR常用的螢光標記

·非特異性螢光標記

——SYBR Green I

——EvaGreen

——LC Green

·特異性螢光標記

——TaqMan

——Molecular Beacon

——Amplisensor

 

qPCR的應用

·基因擴增

·擴增特異性分析

·基因定量分析

·基因檢測

·基因分型

·SNP分析

·RFLP多態性分析

·單/多基因表達研究

·高通量基因表達譜研究

 

目前qPCR技術廣泛應用於生物醫藥食品等行業，運用於疾病的早期診斷、遺傳病的早期診斷、藥物研究、腫瘤的診斷與研究、食品病原微生物的檢測、轉基因食品檢測、動物疫病檢測等。

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