來源：ChemicalBook
背景[1-6]
實時螢光定量PCR服務是當今生物學研究的重要手段之一。包括基礎科學、生物技術、醫學研究、法醫學、診斷學等在內的各領域的科學家們使用這種方法進行廣泛的應用研究。實時螢光定量PCR的主要優點是能夠準確地確定初始模板拷貝數，具有較寬的動態範圍以及較高的靈敏度，滿足定性和定量實驗的需求。科學研究中較為常用的是SYBR Green qPCR和T aqMan探針qPCR。實時螢光定量PCR在PCR擴增過程中，通過螢光信號，對PCR進程進行實時檢測。
由於在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關係，所以成為定量的依據。實時螢光定量PCR是將標記有螢光素的Taqman探針與模板DNA混合後，完成高溫變性，低溫復性，適溫延伸的熱循環，並遵守聚合酶鏈反應規律，與模板DNA互補配對的Taqman探針被切斷，螢光素游離於反應體系中，在特定光激發下發出螢光，隨著循環次數的增加，被擴增的目的基因片段呈指數規律增長，通過實時檢測與之對應的隨擴增而變化螢光信號強度，求得Ct值，同時利用數個已知模板濃度的標準品作對照，即可得出待測標本目的基因的拷貝數。
服務內容：
①引物設計與合成；
②RNA抽提純化；
③基因組DNA消化處理；
④RNA質量檢測；
⑤cDNA合成；
⑥實時螢光定量PCR檢測；
⑦提交實驗數據和報告。
實時螢光定量PCR所使用的螢光物質可分為兩種：螢光探針和螢光染料。現將其原理簡述如下：
TaqMan螢光探針：PCR擴增時再加入一對引物的同時加入一個特異性的螢光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告螢光基團和一個淬滅螢光基團。探針完整時，報告基團發射的螢光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告螢光基團和淬滅螢光基團分離，從而螢光監測系統可接收到螢光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個螢光分子形成，實現了螢光信號的累積與PCR產物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術平臺。
SYBR螢光染料：在PCR反應體系中，加入過量SYBR螢光染料，SYBR螢光染料非特異性地摻入DNA雙鏈後，發射螢光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何螢光信號，從而保證螢光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應是否特異。
3.分子信標：是一種在5和3末端自身形成一個8個鹼基左右的髮夾結構的莖環雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導致螢光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產生螢光。PCR產物生成後，退火過程中，分子信標中間部分與特定DNA序列配對，螢光基因與淬滅基因分離產生螢光。
應用[7][8]
實時螢光定量PCR服務可用於蛋白組學研究中的轉錄水平的驗證服務：
在低溫脅迫下擬南芥差異蛋白質組學研究中以模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)為材料，利用雙向電泳、質譜技術並結合螢光定量PCR方法，對低溫脅迫條件下的擬南芥進行了差異蛋白質組的比較分析，以探索植物的抗寒機制。實驗中對蛋白質樣品製備、上樣方式、雙向電泳參數的選擇等技術環節進行了優化，建立了適合擬南芥蛋白質組學研究的技術平臺。同時進行了蛋白質樣品的分級製備研究，提高了低豐度蛋白的檢測效果。
2-DE圖譜分析結果表明，在低溫脅迫條件下，共檢測到67個蛋白豐度差異表達變化在2倍以上的蛋白點。對其中的57個蛋白點進行了MALDI-TOF-MS分析，有42個蛋白點得到了有效鑑定，包括9個已知的低溫脅迫響應蛋白和在本實驗中首次發現的一些低溫應答蛋白。這些蛋白在代謝、能量、防禦反應等方面發揮重要作用。應用實時螢光定量PCR技術檢測了其中32個蛋白在轉錄水平上的變化，結果顯示mRNA與蛋白質水平的變化並不完全一致。
參考文獻
[1]Characterization of two Arabidopsis thaliana glutathione S-transferases[J].Eliana Nutricati,Antonio Miceli,Federica Blando,Luigi De Bellis.Plant Cell Reports.2006(9)
[2]Overexpression of Multiple Dehydrin Genes Enhances Tolerance to Freezing Stress in Arabidopsis[J].Plant Molecular Biology.2004(5)
[3]Depletion of the high-abundance plasma proteins[J].Amino Acids.2004(3)
[4]The Plant Dehydrins:Structure and Putative Functions[J].Ch.R.Allagulova,F.R.Gimalov,F.M.Shakirova,V.A.Vakhitov.Biochemistry(Moscow).2003(9)
[5]Identification of mitochondrial protein complexes inArabidopsis using two-dimensional blue-native polyacrylamide gel electrophoresis[J].Philippe Giege,Lee Sweetlove,Christopher Leaver.Plant Molecular Biology Reporter.2003(2)
[6]Expression profiles of the Arabidopsis WRKY gene superfamily during plant defense response[J].Jixin Dong,Chunhong Chen,Zhixiang Chen.Plant Molecular Biology.2003(1)
[7]The proteome of the chloroplast lumen of higher plants[J].Photosynthesis Research.2003(3)
[8]席景會.低溫脅迫下擬南芥差異蛋白質組學研究[D].吉林大學，2007.