螢光定量PCR的原理及應用

2021-01-20 鄭州血檢通

一、螢光定量PCR原理


螢光定量PCR（Real-time PCR），是指在PCR擴增反應體系中加入螢光基團，通過對擴增反應中每一個循環產物螢光信號的實時檢測,最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。


以探針法螢光定量PCR為例：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的螢光探針，該探針兩端分別標記一個報告螢光基團和一個淬滅螢光基團。開始時，探針完整地結合在DNA任意一條單鏈上，報告基團發射的螢光信號被淬滅基團吸收，檢測不到螢光信號；PCR擴增時，Taq酶將探針酶切降解，使報告螢光基團和淬滅螢光基團分離，從而螢光監測系統可接收到螢光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個螢光分子形成，實現了螢光信號的累積與PCR產物形成完全同步。



傳統的PCR進行檢測時，擴增反應後需要進行染色處理及電泳分離，並且只能作定性分析，不能準確定量，易造成汙染出現假陽性，使其應用受到限制。實時定量PCR技術不僅實現了對模板的定量，且具有靈敏度高、特異性和可靠性更好、自動化程度高和無汙染的特點，使得螢光定量PCR逐漸取代常規PCR。 


在PCR擴增反應的最初數個循環裡，螢光信號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即是基線，這條線是可以自動生成也可以手動設置的。之後反應會進入指數增長期，這個期間擴增曲線具有高度重複性，在該期間，可設定一條螢光閾值線，它可以設定在螢光信號指數擴增階段任意位置上，但一般會將螢光閾值的預設設置是 3-15 個循環的螢光信號的標準偏差的10 倍。每個反應管內的螢光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數被稱為ct值，這個值與起始濃度的對數成線性關係，且該值具有重現性。



ct值最大的意義就是用來計算目的基因的表達量，此時就有兩個概念容易被提及，那就是絕對定量和相對定量，絕對定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數目，即通常所說的拷貝數。相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數。


ct值誠然可以被利用來計算這兩種定量結果，但是絕對定量實驗必須使用已知拷貝數的絕對標準品，必須做標準曲線。相對定量可以做標準曲線，也可以不做標準曲線。絕對標準品製作困難難以獲取，實驗室基本都是選擇相對定量的方法來計算相對基因表達量。


二、螢光定量PCR的應用


分子生物學研究 


1 核酸定量分析 對傳染性疾病進行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的檢測 ,  轉基因動植物基因拷貝數的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等。


2 基因表達差異分析 比較經過不同處理樣本之間特定基因的表達差異 ( 如藥物處理、物理處理、化學處理等 ) ，特定基因在不同時相的表達差異以及CDNA晶片或差顯結果的確證 


3 SNP 檢測 檢測單核苷酸多態性對於研究個體對不同疾病的易感性或者個體對特定藥物的不同反應有著重要的意義，因分子信標結構的巧妙性，一旦SNP 的序列信息是已知的，採用這種技術進行高通量的 SNP 檢測將會變得簡單而準確。


4 甲基化檢測 甲基化同人類的許多疾病有關，特別是癌症， 在擴增之前先處理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，用特異性的引物和 Taqman探針來區分甲基化和非甲基化的 DNA ，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。


醫學研究

5 產前診斷 人們對遺傳性物質改變引起的遺傳性疾病還無法治療，到目前為止，還只能只能通過產前監測，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發生，如為減少 X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實時螢光定量PCR檢測其Y性別決定區基因是一種無創傷性的方法，易為孕婦所接受。


6 病原體檢測 採用螢光定量PCR檢測技術可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、 結核分枝桿菌、EB病毒和巨細胞病毒等病原體進行定量測定。與傳統的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優點。


7 藥物療效考核 對B型肝炎病毒 (HBV)、C型肝炎病毒 (HCV) 定量分析顯示：病毒量與某些藥物的療效關係。HCV高水平表達，幹擾素治療作用不敏感，而HCV低滴度，幹擾素作用敏感；在拉米夫定治療過程中，HBV- DNA的血清含量曾有下降，隨後若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發生變異。


8 腫瘤基因檢測 儘管腫瘤發病的機理尚未清楚，但相關基因發生突變是致癌性轉變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的表達增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現。實時螢光定量 PCR不但能有效地檢測到基因的突變，而且可以準確檢測癌基因的表達量。目前用此方法進行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細胞性白血病WT1基因、腫瘤 ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關的病毒基因等多種基因的表達檢測。


                                                                     

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