實時螢光定量 PCR詳解

2020-09-24 基因獸

光定量 PCR（Realtime fluorescence quantitative PCR，qPCR）也稱作實時螢光定量 PCR。它是指在 PCR 反應體系中加入螢光基團，利用螢光信號累積實時檢測整個 PCR 進程，最後通過標準曲線對初始模板進行定量分析的方法。該技術於 1996 年由美國 Applied Biosystems 公司推出，它的出現解決了傳統 PCR 不能對初始模板定量分析的問題。螢光定量 PCR 具有準確性高、靈敏度高、特異性強等優點，目前已廣泛應用於分子生物學研究和醫學研究等領域。

螢光定量 PCR 原理

在 PCR 反應體系中加入螢光基團，隨著 PCR 反應的進行，PCR 反應產物不斷累積，螢光信號強度也等比例增加。每經過一個循環收集一個螢光強度信號，通過螢光強度變化檢測產物量的變化，最終得到得到一條螢光擴增曲線圖，擴增曲線橫坐標表示循環數，縱坐標表示螢光強度。

圖 1：qPCR 擴增曲線圖

一般而言，螢光擴增曲線可以分為三個階段：螢光背景信號階段（基線期）、螢光信號指數擴增階段和平臺期。在螢光背景信號階段，擴增的螢光信號被螢光背景信號所掩蓋，無法判斷產物量的變化；在平臺期，擴增產物已不再呈指數級的增加，PCR 的終產物量與起始模板量之間沒有線性關係，根據最終的 PCR 產物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數；只有在螢光信號指數擴增階段，PCR 產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關係。

螢光定量 PCR 常用術語

在了解螢光定量 PCR 如何對初始模板進行定量之前，需要了解幾個在螢光定量 PCR 分析中常用的術語：

l 基線：實時螢光定量 PCR 反應的基線是指在 PCR 的最初幾個循環中（一般為 3-15 個循環）的信號水平。此階段的螢光信號變化量極小。低水平的基線信號相當於反應的背景或噪聲。每個實時螢光定量 PCR 反應的基線應通過用戶分析或擴增曲線自動分析，根據經驗確定。基線的設置，會影響到螢光閾值及 Ct 值。

l 螢光閾值：螢光閾值是在螢光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在螢光信號指數擴增階段任意位置上，但一般螢光閾值的預設值是 PCR 反應前 3-15 個循環螢光信號標準偏差的 10 倍。

l CT 值：CT 值指的是 PCR 擴增過程中擴增產物的螢光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環次數。

l 標準曲線：標準曲線是標準物質的物理/化學屬性跟儀器響應之間的函數關係。對已知拷貝數的標準樣品做系列稀釋，對不同稀釋度的標準樣品進行螢光定量 PCR 並記錄 Ct 值，根據 Ct 值及拷貝數的對數繪製得到標準曲線，標準曲線的縱坐標代表起始拷貝數的對數，橫坐標代 Ct 值。

如何實現對初始模板的定量

利用實時螢光定量 PCR 對樣品的初始模板量進行定量分析，需要利用已知起始拷貝數的標準品作出標準曲線，再通過螢光定量 PCR 獲得未知樣品的 Ct 值，最後從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。

圖 2 ：對初始模板進行定量分析

標準曲線繪製

標準品的製備

設計特定引物，利用 PCR 對目的基因片段進行擴增，隨後將目的基因片段克隆至載體中，測序驗證是否為陽性重組質粒，最後收集陽性克隆質粒作為標準品。

繪製標準曲線

測定質粒的濃度，依據公式計算出質粒的拷貝數。對質粒進行系列稀釋，分別作為模板進行螢光定量 PCR 並記錄Ct 值。最後依據起始拷貝數的對數及 Ct 值繪製標準曲線，得到標準方程。當需要對起始模板進行定量時，只需要得到擴增曲線，讀得 Ct 值，帶入標準方程即可對起始模板定量。

螢光標記方法

實時螢光定量 PCR 螢光標記方法可分為螢光染料和螢光探針兩類，染料類螢光定量 PCR 是利用與雙鏈 DNA 小溝結合發光的理化特徵指示擴增產物的增加；探針類螢光定量 PCR 是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產物的增加。

螢光染料

染料法螢光定量 PCR 是利用螢光染料與雙鏈 DNA 小溝結合發光的理化特徵指示擴增產物的增加。現以最常用的SYBR GreenⅠ為例，介紹染料法螢光定量 PCR 的工作原理：

圖 3：螢光染料法原理

SYBR GreenⅠ是一種螢光染料，可與雙鏈 DNA 非特異性結合。在游離狀態下，SYBR Green Ⅰ發出微弱的螢光，但一旦與雙鏈 DNA 結合，其螢光增加 1000 倍。一個反應發出的全部螢光信號與出現的雙鏈 DNA 量呈比例，且會隨擴增產物的增加而增加，可通過螢光信號的增加來記錄產物的增加。

螢光探針

探針為一段寡核苷酸，可與 DNA 序列特異性結合，一個模板結合一個探針。探針 5』端具有報告基團（R），可發螢光；3』端有螢光淬滅基團（Q），能吸收螢光。探針完整時 R 基團所發射的螢光能量被 Q 基團吸收，PCR 儀檢測不到螢光信號。探針被酶水解後，R 與 Q 分開，PCR 儀可檢測到螢光信號。

Taq 酶有 5』→3』外切核酸酶活性可水解探針，在 PCR 延伸階段探針被 Taq 酶酶切降解，報告基團（R）與淬滅基團（Q）分離，螢光監測系統可接收到螢光信號。每擴增一條 DNA 分子，釋放一個螢光信號，實現了螢光信號的累積與 PCR 產物形成完全同步。

圖 4：探針原理

目前已經開發出來的探針有 Taq Man 探針、Taq man MGB 探針、雙雜交探針、分子信標、Lux 雜交探針、Simple proble 探針等。

探針法與染料法對比

螢光定量 PCR 應用

實時螢光 PCR 技術已廣泛應用於臨床及生命科學研究的各個領域中。在科研方面可定量分析各種基因的表達分析，基因突變和多態性分析，單核苷酸多態 SNP 測定及易位基因的檢測；在醫療方面可用於免疫組化分析、臨床疾病早期診斷、病原體檢測、耐藥性分析、腫瘤微小殘留病變研究等。（轉自先達基因 www.gendx.cn）

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