實時螢光定量PCR的原理及應用

2021-02-08 細胞之邦

1. 基因工程研究領域

①　基因表達研究：對β地中海貧血症患者β與γ珠蛋白mRNA水平進行檢測，其結果特異性強、定量準確，為了解β地中海貧血的分子病理機制及其臨床診斷提供了可靠的檢測數據。

②　轉基因研究：利用兩種發光探針及適當的循環閾值，擴增一個轉移後的基因和一個對照基因，以分析轉基因老鼠接合性。該方法為45個轉基因動物的同型結合及異質結合提供了明確的鑑定結果。通過實時定量PCR檢測，同型結合的異質接合動物交配後其子代中轉基因的傳遞情況符合孟德爾遺傳規律。這項技術在轉基因動物繁育及基因劑量功能效應實驗中將有很大的用途。

③　單核苷酸多態性（SNP）及突變分析：實時螢光定量PCR一個誘人的應用前景是用於檢測基於兩條探針和基因組的不穩定性。基因突變基於兩條探針，一條探針橫跨突變點，另一條為錨定探針，與無突變位點的靶序列雜交。兩條探針用兩種不同的發光基團標記。如靶序列中無突變，探針雜交便完全配對，如有突變，則探針與靶序列不完全配對，會降低雜交體得穩定性，從而降低其熔解溫度（Tm）。這樣便可對突變和多態性進行分析。


2. 醫學研究領域

①　病原體檢測：由於實時螢光定量PCR方法可靠性和重複性好，並且操作簡便、快速、結果判斷客觀，目前，人們用此方法對人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、結核桿菌、巨細胞病毒、EB病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原體的檢測。螢光定量PCR問世後的幾年中，積累了大量有關病原體核酸量與感染性疾病發生、發展和預後之間關係的資料，這些研究資料不斷豐富，將形成感染性疾病的臨床分子診斷標準。

②　藥物療效考核：利用實時螢光定量PCR技術檢測臨床樣品中與抗藥性相關的基因的表達。結果證明，實時螢光定量PCR系統是定量檢測抗藥基因表達的可靠方法，應用這種技術可以預測化療將引起的反應。

③　腫瘤基因檢測：腫瘤的本質是細胞內基因發生了變化，是一種多基因異常的疾病，這些異常變化用實時螢光定量PCR方法都可以檢測出來。  目前用此方法進行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細胞性白血病bcr/abl融合基因、腫瘤MDRI基因、白血病WTI基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關的病毒基因等多種基因的表達檢測。隨著與腫瘤相關的新基因的不斷發現。螢光定量PCR技術將會在腫瘤的研究中發揮更大的作用。


3. 其他領域

用實時螢光定量PCR方法對免疫組分進行分析是其應用的重要方面。 

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    作者：Lemon轉載請註明：解螺旋·臨床醫生科研成長平臺 實時螢光定量PCR是一種在DNA擴增反應中，以螢光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環後產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。實時螢光定量PCR是實驗室最常用的實驗。研究基因在mRNA表達水平,以及驗證基因敲除後下遊靶基因變化情況等等。對於新手來說，如何快速設計引物呢？首先，推薦三個在線設計實時螢光定量PCR引物的網站，不用安裝軟體，直接上網就可搞定。 1.
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