了解實時螢光PCR(real-time PCR)

2021-01-10 鄭州寰基基因

實時螢光PCR（real-time PCR）因其全封閉擴增，簡單快速，重複性好，無擴增後處理以及易於自動化等優點，廣受大家歡迎。在分子診斷領域中，實時螢光PCR方法涉及的領域包括感染性疾病、腫瘤、遺傳病等多方面。那麼實時螢光PCR技術是如誕生的呢？

下面，由小編帶領大家一起了解大牛們是如何經過精密的研究一步一步探索出來這項技術。


1983年美國科學家Kary Mullis發明PCR方法，用於放大擴增特定的DNA片段，可看作是生物體外的特殊DNA複製。

1985年，Cetus公司從溫泉中分離的嗜熱菌（Thermus aquaticus）株中純化出耐熱DNA聚合酶（後面簡稱Taq 酶）。該酶耐高溫的性質極大地提高了PCR擴增的效率，使得PCR真正變為現實，為其自動化鋪平了道路。但是PCR技術也有其相應的局限性，就是對擴增產物分析時需要開蓋處理，容易造成汙染。為了解決這一問題Russ Higuchi進行了一系列相關研究。

1992年，Higuchi在一次報告中提出了實時螢光定量PCR技術。通過檢測溴化乙錠的含量實時監控整個PCR反應的進程。之後經過不斷的研究，通過對PCR反應的數學函數關係、相應的算法以及對標準品的運用，就可以對待測樣品中的目標基因進行準確定量。

1996年ABI公司推出世界上第一臺定量PCR儀7700型。設備由螢光定量系統和計算機組成，通過螢光染料或螢光探針，對PCR產物進行標記跟蹤，結合相應的軟體對結果進行分析，可以實現計算待測樣品的初始模板量。由此，實時螢光PCR技術開始更廣泛的應用。


提到實時螢光PCR技術，首先映入你腦海的是不是TaqMan探針方法和染料方法？其實，實時螢光PCR技術比你想像的更豐富。

下面就讓小編帶你進入實時螢光PCR的世界，一起領略這項技術的豐富多彩。



目前的實時螢光PCR技術主要是基於螢光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，FRET)的原理，一對合適的螢光物質可以構成一個能量供體 (donor) 和能量受體 (acceptor) 對, 其中供體的發射光譜與受體的吸收光譜重疊，當它們在空間上相互接近到一定距離(1~10 nm)時，激發供體而產生的螢光能量正好被附近的受體吸收，使得供體發射的螢光強度衰減，受體螢光分子的螢光強度增強。

 螢光共振能量轉移原理圖


SYBR Green I是一種比較常見的螢光染料，可以非特異的結合雙鏈DNA小溝，它可以嵌合進DNA雙鏈，但不結合單鏈。當SYBR Green I在溶液面未結合雙鏈DNA時，僅產生很少的螢光，當它結合雙鏈DNA時，就發射出很強的螢光信號。由於SYBR Green I能和任何雙鏈DNA結合，無法區分引物二聚體或非特異性擴增產物，一般需要配合熔解曲線分析來排除假陽性。

SYBR Green I作用原理


TaqMan探針是一個與模板特異性結合的螢光探針，它的 5'端標記有螢光報告基團(Reporter, R)，3'端標記有螢光淬滅基團(Quencher, Q)。當探針完整的時候，螢光基團和淬滅基團距離很近，使得螢光基團發射的螢光被淬滅。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針，其5'-3'外切酶活性會切割探針，釋放的5'端報告基團游離於反應體系中，它不受 3'端螢光淬滅基團影響，螢光信號就可以被儀器檢測，積累螢光。也可以說每擴增一條DNA鏈，就形成一個螢光分子，實現了螢光信號的累積與PCR產物形成同步。該技術目前應用較為廣泛，包括人或動物病原體檢測、生物製品鑑定等領域。

TaqMan探針作用原理


雙雜交探針(dual hybridization probe)實時螢光PCR就是在兩條寡核苷酸雜交探針上分別標記螢光供體基團和螢光受體基團，兩基團的激發光光譜有一定程度的重疊。對兩條探針的要求是，其與靶核酸的雜交位置應相互鄰近。當兩條探針與靶基因同時雜交時，兩個螢光基團靠得很近，其間的距離在1~10 nm(通常為1~5個鹼基)，依據FRET原理，在供體基團一定波長的激發光作用下，發生能量傳遞，從而激發受體基團發射另一種螢光，螢光強度和PCR反應中DNA合成量成正比。由於兩個不同的探針必須雜交到正確的靶序列時，才能檢測到螢光，因此，該方法的特異性增強。

圖四. 雙雜交探針作用原理


分子信標(molecular beacon, MB)探針由兩端分別共價標記有螢光基團和淬滅基團的單鏈DNA分子組成，分子信標的環部分和靶核酸互補，而探針的兩頭由於互補而成為莖。當分子信標為莖環結構時，淬滅基團和螢光基團距離很近，報告基團的螢光信號被淬滅基團吸收，從而抑制報告基團產生螢光。在PCR變性階段，該探針的莖部打開形成一條單鏈，當溶液中存在特異性模板時，在復性階段該探針即可與模板雜交，使得5'端螢光基團和3'端淬滅基團分離，螢光信號得以釋放。該方法可以用於基因定量分析、疾病基因檢測和診斷等。

分子信標作用原理


蠍型探針(Scorpions Probes)由探針、引物以及PCR終止子組成。探針部分和分子信標相似，也是5'端有一個螢光基團，3'端有一個淬滅基團，並且呈現莖環結構，與分子信標所不同的是，蠍形探針帶有一段特異引物，可與相應的靶核酸結合，在Taq DNA聚合酶的作用下聚合延伸，得到擴增產物，而所帶探針部分正好可以與延伸端的特異產物中互補序列雜交結合，因此，如有擴增存在，在不斷變性復性過程中，蠍形探針即可不斷與擴增子雜交，莖環結構打開，螢光基團不再被淬滅而被發射出來，螢光強度與擴增產物的含量呈正比。蠍形探針中特異探針序列呈環狀結構，由一個不可擴增的單體即PCR終止子連接於PCR引物的5'端，PCR終止子可防止擴增蠍形探針的莖環部分。

蠍型探針作用原理


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