近日，應用光學國家重點實驗室微納器件與生物光譜研究室史冰博士利用微流控技術，基於連續流動PCR擴增方法，設計了一款基於智慧型手機檢測的手持式集成化實時螢光PCR系統。首次採用高透射率材料—聚氯乙烯（PVC）搭建三維空間微反應器，提高了螢光信號的強度，並通過血漿分離的流感病毒（H7N9禽流感）質粒，細菌（大腸桿菌）質粒和B型肝炎病毒（HBV）的三個常見DNA片段，驗證了本系統實時定量的準確性。
01 研究背景
聚合酶鏈式反應（PCR）技術是1985年出現的一項基因檢測技術，由於PCR技術具有簡便易行、靈敏度高等優點，該技術被廣泛應用於基礎研究，成為分子生物學必不可少的研究工具，可實現核酸分子的定性分析。但許多情況下，核酸分子的定性分析已滿足不了研究需求，因而，核酸分子的精確定量分析成為了熱點研究之一。實時螢光定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）技術實現了PCR從定性到定量的飛躍，它以特異性強、靈敏度高、重複性好、定量準確、速度快、全封閉反應等優點，成為分子生物學研究的又一重要工具。
圖1. qPCR系統的組成
02 手持式集成化實時螢光PCR系統組成
如圖1所示，注射器與鐵絲環構成的簡易內壓式氣體擴散微泵，推動PCR試劑在PVC管道內進行循環；PVC管均勻的纏繞在梯形的矽膠塊上，放置在溫度設定為95℃的加熱片上，使梯形塊上下表面呈現不同的溫度差異以便於PCR反應的進行；用488nm的LED光源，激發每個循環反應後的試劑內的螢光探針，通過舵機帶動的觸控筆使智慧型手機準確記錄每個循環後螢光信號的強弱變化。最後，導出數據在電腦端進行數據分析。qPCR系統的尺寸為16×14×10 cm3，由三節總容量為3500 mAh、工作電壓為12V的18650鋰電池供電。經測試該系統在運行期間的平均功率為9W，在系統充滿電後，可以連續工作約4.66小時。
03 PVC材料與PTFE材料的透光度對比
聚四氟乙烯（Polytetrafluoroethylene, PTFE）俗稱鐵氟龍，是PCR微反應器常用的毛細管材料。但其透光性較差，為了證明PVC材料的透光性高於PTFE材料，我們選取了不同厚度的板材進行比較。如圖2a所示，在波長範圍為400~600nm波段，無論厚度為0.5mm、1mm、還是1.5mm，PVC材料的透光率均高於PTFE材料。同時，採用質粒片段pGEM-3Zf (+)，在PVC微反應器與PTFE微反應器分別進行qPCR反應，如圖2b，所示。圖2b中的四組多對照圖片分別為qPCR反應的第10、20、30、40圈的螢光圖片。從圖中可以清晰的看到，PVC微反應器下獲取的螢光信號均高於PTFE微反應器下的螢光信號。經過計算，PVC微反應器下獲得的螢光信號強度是PTFE微反應器的1.67倍。圖2c為商品化qPCR儀器（CFX Connect, Bio Rad）下的對照組實驗。
圖2. PVC材料與PTFE材料的透光度對比
04 實時螢光定量PCR測試
為了驗證手持式集成化qPCR系統的螢光分析與準確定量檢測能力，我們檢測了嵌入在H7N9禽流感DNA中的質粒。圖3a展示了放大後的螢光圖像，濃度範圍為104 copies/μL ~107copies/μL。圖3b為經過三次重複試驗後，通過提取每個循環通道中PCR試劑的螢光強度峰而產生的擴增曲線。計算出四條曲線的Ct值分別為14.84、19.52、22.96和27.27，R2值為0.9901。從螢光曲線可以直觀地看出，不同濃度的DNA模板分別在不同的循環通道中產生了擴增反應。例如，對於濃度為107 copies/μL的DNA模板，擴增反應大約在第15個周期開始的，濃度為104 copies/μL的DNA模板，擴增反應大約在第30個周期開始。圖3c顯示了來自商用PCR儀器（CFX Connect, Bio Rad）的螢光圖像的擴增曲線。因此，手持式集成化qPCR系統可以快速進行準確的定量檢測。
圖3. 手持式集成化qPCR系統的螢光定量分析
綜上所述，該系統具有較高的集成度以及準確的分析能力，採用高透光PVC材料，提高了系統的螢光信號強度。同時，提高了系統的便攜度，為現場檢測奠定了基礎，在分析檢測領域有著廣泛的應用前景。相關工作已《A handheld continuous-flow real-time fluorescence qPCR system with a PVC microreactor》為題發表於Analyst，145(2020)，26-27。