由於Real-time qPCR的眾多優點，現在已經是生命科學領域的一項常規技術。越來越多的研究文章中涉及RT-PCR的實驗，也基本上被real-time qPCR所代替。由於real-time aPCR 輸出的數據不同於常規的PCR 電泳檢測，很多沒有做過real-time qPCR的研究者常常感到高深莫測，不知從何入手；甚至一些做過次實驗的研究者也會對數據處理分析感到迷惑，不知所措。
本文就從real-time qPCR的發展史說起，包括real-time qPCR的原理，實驗設計，實際操作，數據分析，常見問題解答五個方面，手把手教你從各個方面了解real-time qPCR，徹底的從菜鳥到高手！
一、Real-time qPCR發展史
Real-time qPCR就是在PCR擴增過程中，通過螢光信號，對PCR進程進行實時檢測。由於在PCR擴增的指數時期，模板的Ct 值和該模板的起始拷貝數存在線性關係，所以成為定量的依據。由於常規的PCR的缺點，real-time qPCR由於其操作簡便，靈敏度高，重複性好等優點發展非常迅速。現在已經涉及到生命科學研究的各個領域，比如基因的差異表達分析，SNP檢測，等位基因的檢測，藥物開發，臨床診斷，轉基因研究等。
在Real-time qPCR技術的發展過程中，定量PCR儀的發展起了至關重要的作用。1995年，美國PE公司（已經併入Invitrogen公司）成功研製了Taqman技術，1996年推出了首臺螢光定量PCR檢測系統，通過檢測每個循環的螢光強度，通過Ct值進行數據分析。從而螢光定量PCR獲得廣泛應用。現在的定量PCR儀有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM系列；Roche LightCycler@系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER的LineGene系列。
隨國內生命科學的快速發展，科研水平不斷提高，發高水平文章已不再是新鮮事。與其同時，國內公司經過長期不懈的努力，也有自主研發的real-time PCR儀器生產比如西安天隆科技公司的TL系列儀器。
二、Real-time qPCR概述
1. Real-time qPCR原理
實時PCR就是在PCR擴增過程中，通過螢光信號，對PCR進程進行實時檢測。一般來講，定量PCR儀包括：實時螢光定量PCR儀主要由樣品載臺、基因擴增熱循環組件、微量螢光檢測光學系統、微電路控制系統、計算機及應用軟體組成。其中基因擴增熱循環組件工作原理與傳統基因擴增儀大致相同，不同廠家不同型號的產品分別採用空氣加熱、壓縮機製冷、半導體加熱製冷等工作方式。獨特是這個微量螢光檢測系統。有由螢光激發光學部件、微量螢光檢測部件、光路、控制系統組成。
常用的螢光激發方式有兩種：滷鎢燈和LED；螢光檢測元件常用兩種方式：光電倍增管和冷光CCD攝像機，光單色元件有濾光片和光柵。在實時PCR擴增過程中，螢光信號被收集，轉化為成為擴增和熔解曲線。具體數據就是基線，螢光閾值和Ct值。
2. Real-time qPCR的數學原理
首先來看一個real-time qPCR中的重要參數Ct值（Ct value），閾值（threshold），和基線（baseline）。一般來講，第3-15個循環的螢光值就是基線，是由於測量的偶然誤差引起的。閾值一般是基線的標準偏差的10倍。在實際操作中也可以手動調節，位於指數期就可以。Ct值就是螢光值達到閾值時候的PCR循環次數。所以是一個沒有單位的參數。
那麼為什麼說Ct值跟初始模板的量成反比呢？我們來看PCR的擴增方程：
從線性方程上看，斜率（slope）為-1/lg(1+E)，所以E=10-1/slope-1。如果從標準曲線上得到斜率（-3.3），就可以算出擴增效率（0.99）。一般來講PCR擴增效率在90%-110%都是可以用於數據分析的。效率低於100%，是由於PCR反應中存在抑制因素；而高於100%可能一些汙染、非特異性擴增或者是引物二聚體造成。
3. Real-time qPCR的種類
根據real-time qPCR的化學發光原理可以分為2大類：一類為探針類，包括TaqMan@探針和分子信標，利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產物的增加；一類為非探針類，其中包括如SYBR@Green I或者特殊設計的引物(如LUX@Primers) 通過螢光染料來指示產物的增加。
3.1 Taqman@探針法
Taqman@探針是最早用於定量的方法。就在PCR擴增時加入一對引物的同時加入一個特異性的螢光探針，該探針為一寡核苷酸：5』端標記一個報告螢光基團，3』端標記一個淬滅螢光基團。探針完整時，報告基團發射的螢光信號被淬滅基團吸收，也就是FRET反應；PCR擴增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告螢光基團和淬滅螢光基團分離，從而螢光監測系統可接收到螢光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個螢光分子形成，實現了螢光信號的累積與PCR產物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術平臺。
3.2 分子信標法
分子信標：一種在靶DNA不存在時形成莖環結構的雙標記寡核苷酸探針。在此髮夾結構中，位於分子一端的螢光基團與分子另一端的淬滅基團緊緊靠近。分子信標的莖環結構中，環一般為15-30個核苷酸長，並與目標序列互補；莖一般5-7個核苷酸長，並相互配對形成莖的結構。螢光基團連接在莖臂的一端，而淬滅劑則連接於另一端。分子信標必須非常仔細的設計，以致於在復性溫度下，模板不存在時形成莖環結構，模板存在時則與模板配對。與模板配對後，分子信標的構象改變使得螢光基團與淬滅劑分開。當螢光基團被激發時，它發出自身波長的光子。
3.3 SYBR@Green 法
SYBR@Green I是一種結合於小溝中的雙鏈DNA結合染料，與雙鏈DNA結合後，其螢光大大增強。這一性質使其用於擴增產物的檢測非常理想。SYBR@Green I 的最大吸收波長約為497nm，發射波長最大約為520nm。在PCR反應體系中，加入過量SYBR@Green 螢光染料，SYBR@Green 螢光染料特異性地摻入DNA雙鏈後，發射螢光信號，而不摻入鏈中的SYBR@Green 染料分子不會發射任何螢光信號，從而保證螢光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。
3.4 LUX@Primers法
LUX@ (light upon extention) 引物是利用螢光標記的引物實現定量的一項新技術。目標特異的引物對中的一個引物3』端用螢光報告基團標記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對，形成髮夾結構，使螢光淬滅。在有目標片斷的時候，引物與模板配對，髮夾結構打開，產生特異的螢光信號。
4. Real-time qPCR和常規PCR的區別
實時檢測（在對數擴增時期）而不是終點檢測
敏感性高
需要樣品少
特異性高
精確定量
to be continued....