一、歷史
1993年，日本Higuchi 等人首次採用動態PCR方法和封閉式檢測方式對目的核酸數量進行定量分析，首次提出了螢光定量PCR技術的概念。當時他使用了B（溴乙錠）作為螢光標記染料，採用一臺經過改良的熱循環儀，用UV射線照射樣品然後通過CCD相機檢測產生的螢光值，利用了PCR反應中的數學函數關係，再結合加入標準品的方法，達到了對檢測樣品進行準確定量的目的，但由於這種方法由於有著在實驗儀器資金上巨大的耗費，一些非特異的PCR產物同樣能被檢測到並包含在被測的螢光信號值總量之中而導致定量不準確等因素，最終使這種實驗技術在當時沒能成為主流的實驗技術。1995年美國PE公司成功研製了TaqMan技術，1996年又推出了首臺螢光定量PCR檢測系統，通過檢測每個循環的螢光強度，並使用Ct值進行分析，螢光定量PCR才很快的到大家的接受，並廣為應用。現在的定量PCR 儀有 ABI 7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlus TM、StepOne TM、PRISM® StepOne TM 系列；BIO-RAD 的 CFX96、iCycler iQ5®、MyiQ®、MJ Research Chromo4 TM Opticon 系列；Stratagene Mx TM 系列；Roche LightCycler®系列； Eppendorf Masercycler®；Corbett Rotor-Gene TM；Cepheid SmartCycler® 和 BIOER 的 LineGene 系列。
二、基礎知識
所謂定量 PCR 技術（real-time PCR），是指在 PCR 反應體系中加入螢光基團，利用螢光信號累積實時監測整個 PCR 進程，最後通過特定數學原理對未知模板進行定量分析的方法。
與常規PCR的區別
常規 PCR 中， PCR 產物通過凝膠電泳，然後進行成像分析，常規 PCR 只能通過終點法對擴增產物進行定性分析，而不能進行定量分析；螢光定量 PCR 中， PCR 反應體系中加入了螢光分子，通過螢光信號的變化來反應擴增產物的變化，使 PCR 產物的實時檢測成為可能。相對常規 PCR 而言，螢光定量 PCR 的主要優點是準確地確定初始模版拷貝數和較高的檢測靈敏度；螢光定量 PCR 不僅可用於定性，如判斷一段序列的有無，也可用於定量，如確定起始模版的拷貝數；
常規PCR 的定量方法，測定的都是 PCR 的終產物，而不是起始DNA 拷貝數。而從圖中可以看出，雖然相同模版在同一臺PCR 儀上進行 96 次擴增，終點處檢測產物量不恆定，但96 次PCR 擴增曲線都有一個共同的拐點，即螢光定量PCR 中 Ct 值的重現性，恆定的Ct 值為螢光定量 PCR 的分析提供了理論依據。
三、QPCR檢測方法
Real Time PCR是通過檢測反應體系中的螢光強度來檢測PCR擴增產物的,其螢光檢出方法可分為螢光嵌合法和螢光探針法兩大種類。
螢光嵌合法(SYBR Green I)的原理
螢光嵌合法通常使用SYBR Green I。SYBR Green I是一種能夠結合於所有dsdna雙螺旋小溝區域的具有綠色激髮長的染料。它與PCR合成的雙鏈DNA結合,在激發光照射下產生螢光,通過螢光強度的檢測,可以實時監測PCR擴增的產物量。
螢光探針法的原理
螢光探針有很多種類,這裡介紹兩種螢光探針檢測方法,即 Taqman Probe法和 Cycling Probe法，主要介紹Taqman Probe法
Taqman Probe法
Taqman Probe法是使用5』端帶有螢光物質(如:FAM等),3』端帶有淬滅物質(如: TAMRA、 Eclipse、BH1Q等)的 Taqman探針進行螢光檢測的方法。當探針完整時,5』端的螢光物質受到3』端的淬滅物質的制約,不能檢出螢光。當 Taq Man探針被分解後,5』端的螢光物質便會游離出來,發出螢光。當PCR反應液中加入螢光探針後,在PCR反應的退火過程中,螢光探針便會和模板雜交。進一步在PCR反應的延伸過程中,DNA聚合酶的5』→3』 Exonuclease活性可以分解與模板雜交的螢光探針,游離螢光物質發出螢光,通過榜測反應體系中的螢光強度,可以達到檢測PCR產物擴增量的目的。
如何選擇QPCR檢測方法
四、QPCR 幾個基本概念
擴增曲線
為了更好的理解螢光定量 PCR 原理，我將用樣品擴增曲線來進行說明。 描述 PCR 動態進程的曲線即擴增曲線。 PCR 的擴增曲線實際上並不是一條標準的指數曲線，而是呈 S 型曲線。圖中， X－軸表示 PCR 循環數， Y－軸表示擴增反應的螢光值，與反應管中擴增產物的量有比例關係。
從圖可以很直觀的看出，螢光定量 PCR 擴增曲線可以分成三個階段：螢光背景信號階段（基線期），螢光信號指數擴增階段（對數期）和平臺期。在基線期，擴增的螢光信號被螢光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產物量的變化。而在平臺期，擴增產物已不再呈指數級的增加。 PCR 的終產物量與起始模板量之間沒有線性關係，所以根據最終的 PCR 產物量不能計算出起始 DNA 拷貝數。只有在螢光信號指數擴增階段， PCR 產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關係，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。
螢光閾值
在介紹螢光閾值之前，先了解一下螢光本底信號，我們一般把螢光PCR 的前 15 個循環信號作為螢光本底信號（baseline，基線期），即樣本的螢光背景值和陰性對照的螢光值，擴增的螢光信號被螢光背景信號所掩蓋。螢光閾值是在螢光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在螢光信號指數擴增階段任意位置上，螢光閾值的預設設置是 3～15 個循環的螢光信號的標準偏差的 10 倍（儀器自動設置）。我們在做螢光定量 PCR 實驗時，經常採用手動設置，手動設置的原則要大於樣本的螢光背景值和陰性對照的螢光最高值，同時要儘量選擇進入指數期的最初階段，真正的信號是螢光信號超過域值。
Ct 值
了解了螢光閾值的概念後，Ct 值就很好理解了。C 代表 Cycle，t 代表 threshold，所謂 Ct 值就是在螢光 PCR 擴增過程中，當擴增產物的螢光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環次數。如上文中圖所示，黑色的線顯示的是螢光閾值，當信號超過黑色線時所經歷的循環數即為 Ct 值。從這也可以了解到 Ct 值是可以變化的，我們實驗時帶有一定的人為因素。而螢光定量 PCR 後面的數據處理要用到 Ct 值來計算，所以有關螢光閾值的設置就顯得尤為重要。一般說來，新手按螢光 PCR儀的自動設置為好，而如果你非常有經驗，一般會手動設置螢光閾值。因為 Ct值即達到螢光閾值所經過的循環數，所以它就與模版的拷貝數存在著線性關係，起始拷貝數越多，經過的循環數就越少， Ct 值也就越小，反之亦然。正常的 CT值範圍在 18-30 之間，過大和過小都將影響實驗數據的精度。前面也提到過，同一模板經過 96 次 PCR 擴增，擴增產物雖然不恆定，但Ct 值極具重現性。根據這個特點，我們可以利用已知起始拷貝數的標準樣品的。Ct 值做出標準曲線，只要在同一次 PCR 實驗中得到未知樣品的 Ct 值，就可以根據曲線算出該未知樣品的起始拷貝數。
標準曲線
在絕對定量中，未知樣本的量如基因拷貝數可通過梯度稀釋的已知量的標準品的Ct 值推算出。在實驗過程中，我們可以將已知濃度的標準品進行梯度稀釋（5－6個稀釋梯度），將未知樣品和梯度稀釋的標準品在同一螢光PCR 實驗中進行反應，將稀釋標準品得到的 Ct 值構建標準曲線，通過標準曲線可以推算出未知樣品的量。標準曲線的製作不需要人工操作，由儀器自動完成。理論上，一系列稀釋樣品的擴增曲線之間有均勻的間距，如果PCR反應呈理想的方式擴增，產物在每一循環都加倍，螢光曲線之間的間距則符合等式「2n＝稀釋倍數」，n為 2 樣本間Ct值差。例如：10 倍稀釋的樣本， 2n＝10，可得n3.32，Ct值差3.32。
擴增效率
在絕對定量中，我們將已知模板稀釋成一系列濃度梯度進行螢光 PCR 實驗，利用拷貝數和 Ct 值做成標準曲線，利用遞減的直線關係等式和相關係數（r）或
可信度來計算擴增效率。擴增效率與標準曲線的斜率相關， 計算方程為：擴增效率（E）＝10-1/斜率。理論上，在每個指數擴增循環中， PCR產物的量加倍，即PCR產物 2 倍增加，反應效率為 2，擴增效率就為 2，就可得 2＝10-1/斜率，標準曲線得斜率就為-3.32，斜率的絕對值與螢光曲線間距相同。如果將擴增效率用百分率來表示，即： E%=(E-1)×100%，對於理想的 PCR反應，E=2，即：擴增效率 E%=(2-1)×100%=100%如果 E＝1.92，帶入方程(1.92-1)×100%=92%，表示每個循環的終點，擴增產物的拷貝數增加 1.92 倍，或每次循環有 92％的模板被擴增。一般說來，擴增效率接近 100％是優化的重複性好實驗的最好標誌，實際操作時，反應的擴增效率應該在 90％－105％之間，如果擴增效率低，可能的原因是引物設計不當，或者反應條件未優化；擴增效率大於 100％時，可能的原因是系列稀釋樣品加樣錯誤，或者有非特異性產物擴增，如引物二聚體產生。用上述方法確定擴增效率時，反應體系中的抑制劑的出現也可能導致擴增效率明顯增加，原因是高濃度模板樣本中抑制劑的濃度低，導致反應的 Ct 值延遲出現，而低濃度模板樣本中抑制劑濃度高，反應的 Ct 值延遲程度小，導致斜率的絕對值以及計算所得的擴增效率會增加。如果擴增效率小於 90％或大於 105％，建議重新設計引物或探針。
五、QPCR實驗方法
逆轉錄反應
Two Step rt-pcr和 One Step rt-pcr的選擇
Real Time RT-PCR反應可選擇 Two Step rt-pcr反應或 One Step RT-PCR反應, Two Step RT-PCR反應是將反轉錄反應和 Real Time PCR反應分兩步進行。進行 Two Step RT-PCR反應時,可選擇 Random Primer 、Oligo dtPrimer或基因的特異性引物進行反轉錄反應,然後再將一部分反轉錄反應液(cDNA)作為模板添加到 Real TimePCR反應液中。使用反轉錄引物時可以根據實驗目的選擇最合適的反轉錄引物,如果選擇 Random Primer或 Oligo dtPrimer,合成的cDNA可用於複數種類基因的檢測,cDNA溶液可以穩定地長期保存,供以後解析使用。
One Step rt-pcr的反轉錄反應和PCR反應在同一反應管內連續進行,操作簡單,汙染機率低。但此時的反轉錄反應和PCR反應都並非為各自的最適條件,所以 One Step rt-pcr通常比 Two Step RT-PCR反應效率低。此外,與 Two StepPCR反應相比,反轉錄酶等的使用量多,每個反應的成本相對較高。 One Step rt-pcr反應的反轉錄反應引物只能使基因的特異性PCR下遊引|物,而不能使用 Random primer或 Oligo dt Primer共用引物。基因表達解析等絕大部分RT-PCR,最適合選擇 Two Step rt-pcr反應,而RNA病毒檢測等以基因檢測為目的RT-CR反應,應優先考慮防止汙染,所以最好選擇 One Step rt-pcr反應。
逆轉錄中幾種不同引物的選擇
三種引物與RNA模板的相對位置
RandomPrimer
通常基因表達解析,Random Primer最適合。Random Primer能夠高效率反轉錄全長mRNA,所以不管目的片段在mRNA的任何位置都能很好地進行表達解析。Oligodt Primer:
想從Poly(A)尾開始反轉錄反應時,使用Oligo dt Primer.。但是如果目的片段距離Poly(A)尾過遠,反轉錄效率將會降低。所以,Oligo dt Primer最好與在距離Poly(A)尾1.5kb以內的PcR引物組合使用。
GeneSpecific Primer:
進行 One Step rt-pcr反應時的反轉錄引物只能使用基因特異性下遊引物,而不能使用Random Primer和 Oligo dt Primer。對於基因表達解析這樣的複數基因檢測,不適合使用Gene Specific Primer
QPCR反應
引物和探針設計原則
引物設計原則
探針設計原則
PCR條件優化順序
QPCR結果與數據分析
熔解曲線分析
採用 SYBR Green I螢光嵌合法檢測時,可以通過溶解曲線分析,確認PCR反應的特異性,如下圖所示,融解曲線分析是在PCR反應結束後,將PCR反應液的溫度漸漸升高,實時監測 SYBR Green I的螢光信號強度變化進行的。起初由於PCR擴增產物呈雙鏈,具有較高的螢光信號強度,隨著溫度的漸漸升高,DNA雙鏈漸漸打開,嵌入DNA雙鏈中的 SYBR Green I數量減少,螢光信號強度就漸漸降低,當雙鏈DNA解鏈一半時,螢光信晝強度急劇下降,此時的溫度即融解溫度（Tm值）,Tm值與PCR擴增產物的序列有關,對於某一PCR擴增產物,其值是固定的。左圖為融解曲線的一次曲線,右圖為融解曲線的負一次微分曲線,通常使用融解曲線的負一次微分曲線進行融解曲線分析的較多。
不同溶解曲線
相對定量的數據處理方法
對於不同的實驗需求，我們可以採用不同的方法進行實驗設計和數據分析，一般常用的方法有雙標準曲線法、△Ct、2-△△Ct、用參照基因的△Ct法和Pfaffi
法，應用每種方法都有適應條件。
根據實驗要求可選用相應方法
而目前相對定量普遍採用操作簡便的 2-△△Ct分析方法。
六、常見問題
1、無 Ct 值（信號）出現
（1）反應循環數不夠：一般都要在35 個循環以上，可根據實驗情況增加循環，但高於45 個循環會增加過多的背景信號；
（2）檢測螢光信號的步驟有誤：一般採用72℃延伸時採集螢光，Taqman 方法則一般在退火結束或延伸結束採集信號；
（3）引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性；
（4）探針設計不佳：設計探針溫度低於引物，造成探針未雜交上而產物已延伸；
（5）模板量少：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣品的最高濃度做起；
（6）模板降解：避免樣品製備中雜質的引入以及模板反覆凍融的情況發生
2、值出現過晚
（1反應條件不佳：未最佳反應條件， 可重新設計引物或探針，適當降低退火溫度，增加鎂離子濃度等；
（2）CR各種反應成分的降解或加樣量不夠；
（3）增產物片段過長：一般採用 100－200bp 的擴增長度。
3、陰性對照也出現明顯的擴增
（1）光 PCR mix 或水被汙染；
（2）引物二聚體的出現：在 35 循環後陰性對照出現擴增屬正常情況，可配合溶解曲線進行分析；
4、溶解曲線不止一個主峰
（1）引物設計不佳：避免二聚體和髮夾結構的出現；
（2）引物濃度不佳：適當調整引
（3）退火溫度低：提高退火溫度；
（4）鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度
（5）模板中有基因組的汙染：RNA提物設計避免非特異擴增。
5、擴增曲線不正常，剛進入指數期就很快進入平臺期並向右下彎曲
（1）基線等設置不當：按儀器說明書重新操作；
（2）模板量過多：當擴增曲線在 10 個循環內起峰時，應將模板稀釋 10
倍後使用。
6、重複性不好
（1）加樣不準確；
（2）儀器在樣品上溫度條件有差異，溫度均一性不好；
（3）模板濃度低：樣品初始濃度越低，重複性越差，應減少樣品的稀釋倍數。
7、螢光定量 PCR CT 值一般在多少後認為模板沒擴增
當進入對數期的循環數大於 35 時，RealTime RT-PCR 檢測無效，基因沒有
表達；當進入對數的循環數在 32-35 個循環時，需要有至少 3 個重複才能判斷是否能檢測到基因的表達。