一、Real-time qPCR發展史
Real-time qPCR就是在PCR擴增過程中，通過螢光信號，對PCR進程進行實時檢測。由於在PCR擴增的指數時期，模板的Ct 值和該模板的起始拷貝數存在線性關係，所以成為定量的依據。由於常規的PCR的缺點，real-time qPCR由於其操作簡便，靈敏度高，重複性好等優點發展非常迅速。現在已經涉及到生命科學研究的各個領域，比如基因的差異表達分析，SNP檢測，等位基因的檢測，藥物開發，臨床診斷，轉基因研究等。
在Real-time qPCR技術的發展過程中，定量PCR儀的發展起了至關重要的作用。1995年，美國PE公司（已經併入Invitrogen公司）成功研製了Taqman技術，1996年推出了首臺螢光定量PCR檢測系統，通過檢測每個循環的螢光強度，通過Ct值進行數據分析。從而螢光定量PCR獲得廣泛應用。現在的定量PCR儀有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM系列；Roche LightCycler@系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER的LineGene系列。
隨國內生命科學的快速發展，科研水平不斷提高，發高水平文章已不再是新鮮事。與其同時，國內公司經過長期不懈的努力，也有自主研發的real-time PCR儀器生產比如西安天隆科技公司的TL系列儀器。
二、Real-time qPCR概述
1. Real-time qPCR原理
實時PCR就是在PCR擴增過程中，通過螢光信號，對PCR進程進行實時檢測。一般來講，定量PCR儀包括：實時螢光定量PCR儀主要由樣品載臺、基因擴增熱循環組件、微量螢光檢測光學系統、微電路控制系統、計算機及應用軟體組成。其中基因擴增熱循環組件工作原理與傳統基因擴增儀大致相同，不同廠家不同型號的產品分別採用空氣加熱、壓縮機製冷、半導體加熱製冷等工作方式。獨特是這個微量螢光檢測系統。有由螢光激發光學部件、微量螢光檢測部件、光路、控制系統組成。
常用的螢光激發方式有兩種：滷鎢燈和LED；螢光檢測元件常用兩種方式：光電倍增管和冷光CCD攝像機，光單色元件有濾光片和光柵。在實時PCR擴增過程中，螢光信號被收集，轉化為成為擴增和熔解曲線。具體數據就是基線，螢光閾值和Ct值。
2. Real-time qPCR的數學原理
首先來看一個real-time qPCR中的重要參數Ct值（Ct value），閾值（threshold），和基線（baseline）。一般來講，第3-15個循環的螢光值就是基線，是由於測量的偶然誤差引起的。閾值一般是基線的標準偏差的10倍。在實際操作中也可以手動調節，位於指數期就可以。Ct值就是螢光值達到閾值時候的PCR循環次數。所以是一個沒有單位的參數。
那麼為什麼說Ct值跟初始模板的量成反比呢？我們來看PCR的擴增方程：
從線性方程上看，斜率（slope）為-1/lg(1+E)，所以E=10-1/slope-1。如果從標準曲線上得到斜率（-3.3），就可以算出擴增效率（0.99）。一般來講PCR擴增效率在90%-110%都是可以用於數據分析的。效率低於100%，是由於PCR反應中存在抑制因素；而高於100%可能一些汙染、非特異性擴增或者是引物二聚體造成。
3. Real-time qPCR的種類
根據real-time qPCR的化學發光原理可以分為2大類：一類為探針類，包括TaqMan@探針和分子信標，利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產物的增加；一類為非探針類，其中包括如SYBR@Green I或者特殊設計的引物(如LUX@Primers) 通過螢光染料來指示產物的增加。
3.1 Taqman@探針法
Taqman@探針是最早用於定量的方法。就在PCR擴增時加入一對引物的同時加入一個特異性的螢光探針，該探針為一寡核苷酸：5』端標記一個報告螢光基團，3』端標記一個淬滅螢光基團。探針完整時，報告基團發射的螢光信號被淬滅基團吸收，也就是FRET反應；PCR擴增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告螢光基團和淬滅螢光基團分離，從而螢光監測系統可接收到螢光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個螢光分子形成，實現了螢光信號的累積與PCR產物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術平臺。
3.2 分子信標法
分子信標：一種在靶DNA不存在時形成莖環結構的雙標記寡核苷酸探針。在此髮夾結構中，位於分子一端的螢光基團與分子另一端的淬滅基團緊緊靠近。分子信標的莖環結構中，環一般為15-30個核苷酸長，並與目標序列互補；莖一般5-7個核苷酸長，並相互配對形成莖的結構。螢光基團連接在莖臂的一端，而淬滅劑則連接於另一端。分子信標必須非常仔細的設計，以致於在復性溫度下，模板不存在時形成莖環結構，模板存在時則與模板配對。與模板配對後，分子信標的構象改變使得螢光基團與淬滅劑分開。當螢光基團被激發時，它發出自身波長的光子。
3.3 SYBR@Green 法
SYBR@Green I是一種結合於小溝中的雙鏈DNA結合染料，與雙鏈DNA結合後，其螢光大大增強。這一性質使其用於擴增產物的檢測非常理想。SYBR@Green I 的最大吸收波長約為497nm，發射波長最大約為520nm。在PCR反應體系中，加入過量SYBR@Green 螢光染料，SYBR@Green 螢光染料特異性地摻入DNA雙鏈後，發射螢光信號，而不摻入鏈中的SYBR@Green 染料分子不會發射任何螢光信號，從而保證螢光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。
3.4 LUX@Primers法
LUX@ (light upon extention) 引物是利用螢光標記的引物實現定量的一項新技術。目標特異的引物對中的一個引物3』端用螢光報告基團標記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對，形成髮夾結構，使螢光淬滅。在有目標片斷的時候，引物與模板配對，髮夾結構打開，產生特異的螢光信號。
4. Real-time qPCR和常規PCR的區別
實時檢測（在對數擴增時期）而不是終點檢測
敏感性高
需要樣品少
特異性高
精確定量
三、Real-time qPCR實驗設計
實驗設計其實比實驗本身更重要！好的實驗設計可以事半功倍，節省時間！尤其做生物實驗，一定要查詢儘可能完全的相關資料，整理好思路，設計好實驗路線。當然實驗過程中出現各種各樣的變化，但有足夠多的背景知識，就可以分析原因，才有可能創新。對於一個real-time qPCR而言，首先就是實驗材料的處理和準備；然後引物設計，這步至關重要，好的引物是實驗本身成功的50%；進行實驗和數據分析（這一部分單獨說明）。
1. 實驗材料的處理和準備
以最基本的基因表達差異分析為例。實驗材料分為對照組（CON）和處理組（TRT）。組內要有生物重複，可以數據分析此處理是否有統計意義。在材料收集過程中，儘量避免RNA的降解（尤其對於絕對定量的樣品）。
一般傳統的收集材料的方法是樣品採集立刻液氮速凍，然後迅速轉移到超低溫冰箱保存，但這種方法攜帶不方便，由於對於異地取材。現在新技術的發展，也有一些非液氮類的樣品儲存液 ，比如***的RNAfixer 。
2. 引物設計
一般real-time PCR引物的設計遵循下面一些原則：
擴增產物長度在80-150bp。
引物應用核酸系列保守區內設計並具有特異性。
產物不能形成二級結構。
產物長度一般在15-30鹼基之間。
G+C含量在40%-60%之間。
鹼基要隨機分布。
引物自身不能有連續4個鹼基的互補。
引物之間不能有連續4個鹼基的互補。
引物5』端可以修飾。
引物3』端不可修飾。
引物3』端要避開密碼子的第3位。
Taqman@探針的設計稍有不同，一般有公司設計合成。遵循下面以下原則：
儘量靠在上遊引物；
長度30-45bp，Tm比引物高至少5℃；
5』端不要是G，G會有淬滅作用，影響定量
四、Real-time qPCR操作過程
1. RNA提取和反轉錄
在抽提RNA過程中任一環節的不正確操作都可能導致RNA酶的汙染。由於RNA酶的活性很難完全抑制，預防其汙染是十分必要的。在實際的操作中應遵循下面一些原則：
1. 全程佩戴一次性手套。皮膚經常帶有細菌和黴菌，可能汙染RNA的抽提並成為RNA酶的來源。培養良好的微生物實驗操作習慣預防微生物汙染。
2. 使用滅菌的，一次性的塑料器皿和自動吸管抽提RNA，避免使用公共儀器所導致的RNA酶交叉汙染。例如，使用RNA探針的實驗室可能用RNA酶A或T1來降低濾紙上的背景，因而某些非一次性的物品（如自動吸管）可能富含RNA酶。
3. 在提取裂解液中，RNA是隔離在RNA酶汙染之外的。而對樣品的後續操作會要求用無RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小時。塑料器皿可以在0.5M NaOH中浸泡10分鐘，用水徹底漂洗乾淨後高壓滅菌備用。
當然，這些也不是絕對的要求。如果是操作熟練。完全可以用初次開封的離心管和槍頭，新過濾的超純水，進行RNA的提取。
2.Mix配製
一般來講，進行real-time qPCR MasterMix都是2×的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。由於real-time qPCR靈敏度高，所以每個樣品至少要做3個平行孔，以防在後面的數據分析中，由於Ct相差較多或者SD太大，無法進行統計分析。通常來講，反應體系的引物終濃度為100-400mM；模板如果是總RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情況下是1ul或者1ul的10倍稀釋液，要根據目的基因的表達豐度進行調整。當然這些都是經驗值，在操作過程中，還需要根據所用MasterMix，模板和引物的不同進行優化，達到一個最佳反應體系。在反應體系配置過程中，有下面幾點需要注意：
1. MasterMix不要反覆凍融，如果經常使用，最好溶解後放在4度。
2. 更多的配製Mix進行，減少加樣誤差。最好能在冰上操作。
3. 每管或每孔都要換新槍頭！不要連續用同一個槍頭加樣！
4. 所有成分加完後，離心去除氣泡。
5. 每個樣品至少3個平行孔。
參比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（現在已經是ABI的註冊商標了！）或者其他染料，只要不影響檢測PCR產物的螢光值就可以。參比染料的作用是標準化螢光定量反應中的非PCR震蕩，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個穩定的基線。現在很多公司已經把ROXTM配製在MasterMix或者Premixture裡。如果反應曲線良好或已經優化好反應體系，也可以不加ROXTM染料校正。
通常來講，real-time qPCR的反應程序不需要像常規的PCR那樣，要變性、退火、延伸3步。由於其產物長度在80-150bp 之間，所以只需要變性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR擴增程序結束後，加一個溶解程序，來形成溶解曲線，判斷PCR產物的特異性擴增。而溶解程序，儀器都有默認設置，或稍有不同，但都是一個在產物進行溶解時候，進行螢光信號的收集。
3. 儀器設置
所有儀器的操作都基本一致。設置的時候包括反應板設置（plate setup）和程序設置（program setup）。我們以 ABI StepOne為例，詳細看一下反應設置：
A. 首先是實驗目的選擇：定量還是其他。我們命名為「BioTeke」，進行「定量」實驗。
B. 實驗方法的選擇：我們選用的比較Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA為模板進行。
C. 目的基因的設置：有幾個目的基因和目的基因的名稱。
D. 樣品的設置：包括哪個是實驗組，哪個是對照組。以及負對照的設置和生物重複的設置。
E. 對照組和內參基因的設置：這個是為後面的定量做準備
F. 反應程序的設置：PCR反應程序的設置要根據不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分鐘）。循環反應是95℃15秒，60℃15秒的40個循環。溶解曲線程序採用儀器默認設置就可以。或者是儀器說明書上建議的程序。
G. 反應體系的設置：
A-G這五個步驟簡單設置好，可以保存，修改反應程序或者立刻進行反應。
需要注意一點ABI儀器需要加ROX參比染料，默認的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配製在MasteMix裡面；也有的是單獨分開。要根據不同公司的MasterMix進行這一個步驟的選擇。BioTeke的MasterMix裡沒有參比染料，所以選擇「none」。
設置好之後，就可以把配置好的PCR管放進儀器，點擊RUN！
五、Real-time qPCR數據分析
1. Real-time qPCR常見參數
基線（baseline）
通常是3-15個循環的螢光信號
同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線
閾值（threshold）
自動設置是3-15個循環的螢光信號的標準偏差的10倍
手動設置：置於指數擴增期，剛好可以清楚地看到螢光信號明顯增強。
同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值，但對於同一個基因擴增一定要用同一個閾值。
Ct值:與起始濃度的對數成線性關係。
分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導致定量的不準確。
Rn（Normalized reporter）是螢光報告基團的螢光發射強度與參比染料的螢光發射強度的比值。
△Rn：△Rn是Rn扣除基線後得到的標準化結果（△Rn=Rn-基線）。
2.影響Ct值的關鍵因素
模板濃度
模板濃度是決定Ct的最主要因素。控制在一個合適範圍內，使Ct在15-35之間。
反應液成分的影響
任何分子的螢光發射都受環境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。
PCR反應的效率
PCR反應的效率也會影響Ct值。在PCR擴增效率低的條件下進行連續梯度稀釋擴增，與PCR擴增效率高的條件下相比，可能會所產生斜率不同的標準曲線。PCR效率取決於實驗、反應混合液性能和樣品質量。一般說來，反應效率在90-110%之間都是可以接受的。
3. 如何評估實時定量PCR反應的效果
PCR擴增效率：
為了正確地評估PCR擴增效率，至少需要做3次平行重複，至少做5個數量級倍數(5logs)連續梯度稀釋模板濃度。
R2值：
另一個評估PCR效率的關鍵參數是相關係數R2，它是說明兩個數值之間相關程度的統計學術語。如果R2等於1，那麼你可以用Y值（Ct）來準確預測X值（量）。如果R2等於0，你就不能通過Y值來預測X值。R2值大於0.99 時，兩個數值之間相關的可信度很好。
精確度:
標準偏差（standard deviation，偏差的平方根）是最常用的精確度計量方法。如果許多數據點都靠近平均值，那麼標準偏差就小；如果許多數據點都遠離平均值，則標準偏差就大。實際上，足夠多重複次數產生的數據組會形成大致的正態分布。這經常可通過經典的中心極限理論來證明，獨立同分布隨機變量在無限多時趨向於正態分布。如果PCR反應效率是 100%，那麼2倍稀釋點之間的平均Ct間隔應該恰為1個Ct值。要以99.7%的機率分辨2倍稀釋濃度，標準偏差就必須小於等於0.167。標準偏差越大，分辨2倍稀釋的能力就越低。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋，標準偏差必須小於等於 0.250。
靈敏度：
無論CT絕對值是多少，任何能夠有效擴增和檢測起始模板拷貝數為1的系統都達到了靈敏度的極限。PCR效率是決定反應靈敏度的關鍵因素。在檢測極低拷貝數時的另一個重要的考慮因素是，低拷貝時的模板數量不能按普通情況來預期。相反，它會遵循泊松分布，即進行大量的平行重複，平均應該含有一個拷貝的起始模板，實際上約37%不含有拷貝，僅有約37%含有1個拷貝，約18%實際上含有兩個拷貝。因此，為了更可靠地檢測低拷貝，必須做大量的平行重複實驗來提供統計顯著性，並克服泊松分布的限制。評價螢光PCR結果的標準
因素 建議 指標
效率 5個數量級梯度稀釋 Slope～-3.3 R2>0.99
精密度 至少3個重複 標準差<0.25（0.5或者1個Ct之內）
靈敏度 增加低濃度樣本的重複數 統計分析
除了這些因素，還必須評估和驗證合適的實驗對照（如無模板對照，無 反轉錄酶對照等）以及模板質量。
3. Real-time qPCR定量方法
可以分絕對定量和相對定量。絕對定量是用一系列已知濃度的標準品製作標準曲線，在相同的條件下目的基因測得的螢光信號量同標準曲線進行比較，從而得到目的基因的量。該標準品可以是純化的質粒DNA，體外轉錄的RNA，或者是體外合成的ssDNA。相對定量可以分比較Ct法和其他一些相對方法。比較Ct指的是通過與內參基因Ct值之間的相差來計算基因表達差異,也稱之是2-△△Ct。
3.1 絕對定量
3.2 2-△△Ct定量
3.3 其他定量方法
Marisa L. Wong and Juan F. Medrano: BioTechniques July 2005
六、Real-Time qPCR常見問題分析
1.無Ct值出現
檢測螢光信號的步驟有誤: 一般SG法採用72℃延伸時採集，Taqman法則一般在退火結束時或延伸結束採集信號。
引物或探針降解: 可通過PAGE電泳檢測其完整性。
模板量不足: 對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
模板降解: 避免樣品製備中雜質的引入及反覆凍融的情況。
2. Ct值出現過晚（Ct>38）
擴增效率低: 反應條件不夠優化。設計更好的引物或探針；改用三步法進行反應；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。
PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足。
PCR產物太長: 一般採用80-150bp的產物長度。
3. 標準曲線線性關係不佳
加樣存在誤差: 使得標準品不呈梯度。
標準品出現降解: 應避免標準品反覆凍融，或重新製備並稀釋標準品。
引物或探針不佳: 重新設計更好的引物和探針。
模板中存在抑制物，或模板濃度過高
4. 負對照有信號
引物設計不夠優化：應避免引物二聚體和髮夾結構的出現。
引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，並注意上下遊引物的濃度配比。
鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。
模板有基因組的汙染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。
5. 溶解曲線不止一個主峰
引物設計不夠優化：應避免引物二聚體和髮夾結構的出現。
引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，並注意上下遊引物的濃度配比。
鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的 mix 試劑盒。
模板有基因組的汙染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。
6. 擴增效率低
反應試劑中部分成分特別是螢光染料降解。
反應條件不夠優化：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。
反應體系中有PCR反應抑制物：一般是加入模板時所引入，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系中，減少抑制物的影響。
7. 同一試劑在不同儀器上產生不同的曲線，如何判斷？
判斷標準：擴增效率，靈敏度，特異性
如果擴增效率在90%-110%，都是特異性擴增，都可以把數據用於分析。
8. 擴增曲線的異常？比如「S」型曲線？
參比染料設定不正確(MasterMix不加參比染料時，選NONE)
模板的濃度太高或者降解
螢光染料的降解
本文轉自SCI論文服務公眾號