qPCR和RT-PCR知多少?

2021-02-20 深圳中禾生物

RT-PCR VS qPCR

Real-time PCR(實時螢光定量PCR)和Reverse transcription PCR(反轉錄PCR)看起來都可以縮寫為RT-PCR,但是,國際上的約定俗成的是:RT-PCR特指反轉錄PCR,而Real-time PCR一般縮寫為qPCR(quantitative real-time PCR)。

那麼,反轉錄定量PCR即可寫成:RT-qPCR。

注意:qPCR不一定與反轉錄相關,除了可以用cDNA作為模板,也可以用基因組 DNA等作為模板。而反轉錄PCR也不一定非要與螢光定量相關,從mRNA中反轉錄得到cDNA,然後PCR擴增出目的基因,這也是反轉錄PCR。

因此,那RT-qPCR(也有人寫成qRT-PCR)就很好理解了,就是結合了螢光定量技術的反轉錄PCR,即:先從RNA反轉錄得到cDNA(RT),然後用Real-time PCR進行定量分析(qPCR)。

反轉錄PCR

RT—PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)是將RNA的反轉錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈式擴增(PCR)相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用,從RNA合成cDNA,再以cDNA為模板,在DNA聚合酶作用下擴增合成目的片段。RT—PCR技術靈敏而且用途廣泛,可用於檢測細胞中基因表達水平、細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物。無論使用何種RNA,關鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的汙染。用於反轉錄的引物可視實驗的具體情況選擇隨機引物、Oligo dT及基因特異性引物中的一種。對於短的不具有髮夾結構的真核細胞mRNA,3種都可。

實時螢光定量PCR 

實時螢光定量PCR反應指的是在PCR進行的同時,對其過程進行監測(即實時),一般簡寫為(qPCR)。實時定量PCR與終點PCR(Endpoint PCR)的區別在於數據可在PCR擴增過程中進行收集。在實時螢光定量PCR中,反應以循環中首次檢測到目標擴增的時間點為特徵,目標核酸的起始拷貝數越高,則會越快觀察到螢光的顯著增加(擴增曲線越靠近的X值越低)。相反,終點法檢測(也稱 「讀板檢測」)測量的是PCR循環結束時累計的PCR產物量。

視頻名稱:實時螢光定量PCR原理及RT-PCR(qPCR);來源:Thermo Fisher website

總策劃:東老師

編審:胡老師

審核:鍾老師

改編自:植物分子研究、科研利器、百度百科

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