回顧自己的研究生三年生活，PCR和Western blot簡直就是親爹親媽了，雖然我也做了很duo(shao)的其他實驗去證明我的課題，但是很羞愧地說大部分實驗數據還是出自親爹親媽之手，親媽Western絕對是個喜怒無常的虎媽，但是親爹PCR並沒有為了平衡家庭關係而表現出貓爸的姿態，事實上，他矯情，事兒又多，簡直就是實驗版的Sheldon。最高紀錄一天跑了整6板，加樣加到手腕酸，加到最後，都不知道自己在做什麼了，如同一個殭屍橫在實驗室裡，身體上的累不算什麼，要是碰上跑出來的結果ct值很高，復孔之間結果相差太大，白做了一天的實驗，真是深受一萬點暴擊，這個世界對我太不友好了。。。。。。身邊有很多課題組都不做qPCR，他們的導師說qPCR的結果不準，也容易數據造假，對於這點我也很無奈，但是小編會的真不多，我這種「老牛耕地式」做實驗的方法，真的只能在失敗中不斷的吸取經驗，完善過程。
（課題雖小，也要保持驕傲的姿態）
提取RNA這一塊兒，每個實驗室都有自己熟悉的一套操作流程，大致相差不到哪兒去，這裡主要注意的就是提取RNA的濃度和完整性。
在qPCR之前，首先要做的就是逆轉錄，以RNA為模板合成DNA。我們從樣本中提取mRNA，體外模擬整個生物過程，在逆轉錄酶的作用下，合成出互補的cDNA，構建cDNA文庫，並從中篩選特異的目的基因。具體的操作過程根據使用的不同公司的試劑會有所不同，但整個逆轉錄過程需要注意幾點：
1、整個過程需在冰盒或冰上操作，防止RNA降解；
2、如果你使用的逆轉錄試劑不是一步法，建議每步操作降到4度後，再加下一步試劑，以免影響逆轉錄效果；
3、保證逆轉錄的一致性和高效性
接下來，敲重點了！！！
加樣之前，腦子要清楚自己的實驗設計和排版。96個孔，很容易在加樣過程中出現錯誤，所以建議事先在紙上記清的版面設計，好記性不如爛筆頭嘛。實驗設計是整個實驗的核心，合理的設計實驗組、對照組以及空白對照（NTC）才能使計算出的結果真實可信。但是現實操作中，很多人因為麻煩不設置NTC的設置，有經驗的人可能以某個經驗值來判斷陰陽性，或者乾脆忽略，這種馬虎的操作很容易造成結果的假陽性或假陰性。NTC設置是有其重要性在的，所以每一次qPCR實驗都不應忽略，否則無法判斷待測樣本的性質。
（來自網絡）
那麼RT-qPCR無非就是SYBR螢光染料和Taqman探針兩種手段：
總結一下幾個要點：
1、實驗組、對照組、NTC各組要設計明確；
2、儘量保證各組的取材時間、部位、處理條件等一致；
3、所用的實驗器械、容器需用RNase-free水浸泡，試劑也需用RNase-free水配製；
4、動物組織取材時，要快速地處死動物，取組織，用PBS去除表面血液，並放入液氮中速凍；
5、提取細胞核酸時，可使用足量的TRIZOL對細胞進行裂解，並用移液器輕輕反覆吹吸，充分裂解。
6、如果沒有出現CT值，可能是由於模板量不足，或是由於反覆凍融、樣品汙染導致的模板降解；
7、如果CT值出現的較晚，比如說當CT值大於38時，這反映出該實驗的擴增效率低，反應條件不合適，若果不是引物的問題，可以通過梯度退火實驗找到合適的退火溫度；或者加樣時產生的誤差；
8、溶解峰反應的是在該反應中擴增出來的產物的量。如果溶解曲線出現雙峰，很有可能是上下遊引物比例配置有問題，或者是在RNA提取過程中不小心引入了基因組DNA，可以通過改進以上兩點避免非特異性擴增；
9、結果計算方面：經常在網上看到有小白問，怎麼計算PCR結果。
給大家匯總一下：
絕對定量下：理想的PCR反應：X=X0*2n 非理想的PCR反應：X=X0 (1+Ex)n
n：擴增反應的循環次數
X：第n次循環後的產物量
X0：初始模板量
Ex：擴增效率
log X0= -log(1+Ex) *Ct+ log X
Log濃度與循環數呈線性關係，根據樣品擴增達到域值的循環數即Ct值就可計算出樣品中所含的模板量。
還有就是我們常用的相對定量：
實驗組內參CT
實驗組目的CT
對照組內參CT
對照組目的CT
a
b
c
d
2-△△CT=2-(△CT1-△CT2)=2-[(b-a)-(d-c)]
結果表示實驗組目的基因的表達是對照組目的基因表達的多少倍。
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