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作為在實驗室奮鬥的「奮青」們，都知道Realtime PCR(RT-PCR)是並列於western blot的基礎實驗之一。不會做PCR的人都不好意思說自己在搞科研，呵呵噠。作為一門核心技術，也是相對來說出結果快速的技術，本次小筆將一改逗比風格，高冷正經臉來分享該技能，各位接好了啊。
RT-PCR原理的話簡單來說，就是採用螢光基團標記的特異性探針來跟蹤PCR產物，做到全程監控，後期結合電腦軟體分析定量得出待測樣品的初始量。步驟如下：
1. RNA提取和測定
（1）平衡：-80℃取出TRIZOL裂解的細胞（也可以當時裂解；如果是組織，需要超聲破碎後再進行後續步驟），置於室溫使其完全溶解（3-5min左右）；
（2）分離：隨後按照裂解液：氯仿（5：1）的比例加入氯仿，劇烈震搖30 S（自認為手勁兒大的就手動搖，扛不住的話也可以渦旋儀，當然我是一直手動的哈哈）後，室溫靜置3min，4℃，13,000rpm離心10 min，取上清置於乾淨的RNAfree的EP管中。
【小提示：取上清的時候很容易將中間層的絮狀物吸出，導致蛋白質汙染，可以採用PhaseLock Gel的離心管，有效分層水相和有機相，避免吸取的上清混雜雜質。】
（3）沉澱：在上清中加入等體積的異丙醇，輕微上下翻動混合，冰上孵育20min後，4℃，14,000rpm離心20 min，管底部有可見沉澱，即為RNA（如果裂解的細胞較少，沉澱可能肉眼看不見）。
（4）清洗乾燥：輕柔的倒掉上清，每管加入1 ml 75%乙醇溶液（採用DEPC水配置），混勻，4℃，14,000 rpm離心15 min。小心倒掉上清，於超淨臺邊緣乾燥5min。
（5）溶解測定：根據具體的RNA的量，加入適當的DEPC水溶解（沉澱可見，加入的DEPC水多一些，反之少加），靜置後即可於nanodrop檢測濃度（一般我們暫定A260/A280比值在1.8-2.0即可使用）。
2. cDNA合成
說了這麼多終於完成了第一大步，雖然步驟看似較多，但是掌握後還是蠻簡單的，而且在做該步驟的時候還可以穿插很多其他的實驗，非常不佔用時間。
在小筆的實驗中，採用的是TransScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix試劑盒，只需要根據試劑盒說明書的配比加入八連排管，設置好程序即可。
當然，每個實驗室使用的試劑盒不同，具體根據各自實際情況來定，但是原理是相同的，最終得到cDNA產物即可，儲存於-20℃備用。
3. RT-PCR
這部分其實是最簡單也是最難的一步，簡單在於只要把相應的引物，cDNA產物，SubGreen染料等以合適的比例混合在一起即可；而難點在於加樣的精準性，會極大的影響實驗的結果。
我以ABI 7500fast為例，採用subgreen螢光染料，按照以下反應體系進行配比：
序號
反應物
劑量 μL
1
上遊引物Forward
0.6
2
下遊引物Reverse
0.6
3
SubGreen染料
10
4
cDNA
5
5
DEPC水
3.8
總
20 μL
反應溫度為:
95℃預變性3min, 隨後40個PCR循環（95℃ 3 seconds；60℃ 31 secends），最後加上溶解曲線即可。
最後得出以上這樣的曲線，如何解讀下期說啦。
備註：因為ABI的這臺儀器可以全自動分析實驗數據，操作較為簡單。其他儀器要根據相應的操作手冊來進行，要注意各自的反應體系和溫度設置，不同儀器會略有差異。
最後幾點重要的小提示：
1. 最後進行PCR後的PCR產物可以通過瓊脂糖凝膠電泳來檢測其產物是否是單一的擴增條帶，小筆比較懶，較少採用該步驟。
2. PCR引物的設計也是十分重要的環節。設計不合理，很容易P出不對的結果或者根本P不出來，下次有時間再專門講解如何設計合適的引物。
3. 最最重要的是，提取RNA的所有的操作過程都要保證無汙染，比如使用RNAfree的EP管，採用DEPC水，戴口罩和手套等等；PCR的過程要保證精準度，新手可能一次性加滿96孔板會導致復孔結果偏差很大，先少後多，保證質量，相信我，不然一溜加完加到手酸無比，也出不來好的結果的時候，你會崩潰的。
RT-PCR從收細胞開始到最後出結果，看似時間很長，但是可以一次得到很多結果，還是屬於高效性的實驗，只要把握實驗的關鍵技術難點，出數據是分分鐘的事情，好啦，囉嗦到此，諸位使出洪荒之力好好做實驗吧。
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