手把手教你螢光定量PCR(一)

2021-01-20 醫學方


  首先簡單介紹一下實驗中所用化學試劑耗材清單和作用，做到實驗時心中有數。


Trizol

氯仿

異丙醇

無水乙醇

DEPC水 (焦磷酸二乙酯)

Random primer

逆轉錄酶(AMV)及其buffer

RNase inhibitor

新的沒有用過的槍頭

384孔板（透明）

DVD光碟（刻錄拷貝數據）

八連PCR管

SYBR Master Mix





Trizol主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，則其主要作用是裂解細胞、抑制RNAse活性和蛋白質變性


氯仿作用（1）變性蛋白，（2）抽取苯酚，促進水相和有機相分離；（3）去除脂溶性物質如油脂。配合的異戊醇的作用是消泡。
三層：上清RNA 苯酚氯仿 DNA 下層蛋白質

異丙醇作用：破壞核酸的氫鍵而促進其從水相中沉澱，配合使用的醋酸銨等鹽則中和核酸負電荷，加速核酸聚積沉澱。

75%乙醇的作用是去除異丙醇和其它鹽分。

DEPC水 (焦磷酸二乙酯)是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。






  

在所有RNA實驗中，最關鍵的因素是得到全長的RNA。實驗失敗的主要原因是RNA酶的汙染。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。RNA酶最主要的潛在汙染源是研究人員的手。因此操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。設置RNA操作專用實驗室，所有器械等應為專用。



低溫下操作


最大起始量107個細胞，六孔板每孔加入Trizol 1ml，充分混勻裂解細胞，吹打至無粘稠 (室溫靜置15min充分裂解)。

混勻，加入267ul氯仿（按照氯仿與Trizol體積比200ul/0.75ml），充分震蕩混勻，冰上3min。

12000g，15min，4℃。


小心吸取上清水相至新的Ep管中（約500ul），用200ul槍頭吸出（千萬不要吸入中間界面酚氯仿層）。

加入500ul (終濃度50%) 異丙醇沉澱RNA，室溫靜置30min, 或充分沉降-20度過夜。

15000g，15min，4℃。

此時可看到管底白色沉澱，即為RNA，小心棄掉上清，加入1ml75%乙醇（無水乙醇和DEPC水配置），洗滌沉澱RNA。

12000g，1min，4℃。

棄掉75%乙醇，重複洗一次後，空離十幾秒，在超淨臺內將剩餘液體吸乾(大槍頭套小槍頭)，並置於超淨臺內風乾。

根據RNA量,加入15-30ul DEPC水，吹打將RNA沉澱懸浮混勻。

37℃烘箱放置30min（充分溶解，此步可省略）。

Nanodrop 定量,加入2ul，根據定量結果，將RNA稀釋為1ug/ul。

OD260-280=1.8-2.0比較好

OD260-280<1.8   蛋白汙染

OD260-280>2.2   RNA降解


此步可省略,取1ul電泳，剩餘存放-20℃備用（75%乙醇（無水乙醇和DEPC水配置1年））。

【檢測RNA的條件較為嚴格，電泳槽最好用1*TAE清洗乾淨，電壓130V，10-15min，正常電泳條帶為三條：<2500（28S），<1000（18S），<250（5S），最上一條最亮，是中間一條的2倍，最下一條最暗。】


是不是很簡單呢,其實做實驗我們要知道每步加入試劑的作用和意義，做到心中有數，小心謹慎，熟能生巧，那從實驗菜鳥進階到實驗高手也是很簡單的事情。如果我們成功抽提RNA,接下來我們可以反轉錄cDNA進行Real-time PCR實驗，詳細步驟請見手把手教你螢光定量PCR（二）。



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