螢光定量PCR技術原理，螢光定量PCR的應用有哪些？-菲優特檢測

2020-08-27 菲優特檢測

螢光定量檢測

螢光定量檢測根據所使用的標記物不同可分為螢光探針和螢光染料。螢光探針又包括Beacon技術(分子信標技術，以美國人Tagyi為代表)、 TaqMan探針(以美國ABI公司為代表)和FRET技術(以羅氏公司為代表)等;螢光染料包括飽和螢光染料和非飽和螢光染料，非飽和螢光染料的典型代 表就是現在最常用的SYBR GreenⅠ;飽和螢光染料有EvaGreen、LC Green等。

螢光定量PCR原理

螢光定量PCR最早稱TaqMan PCR，後來也叫Real-Time PCR，是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研製出來的一種新的核酸定量技術。該技術是在常規PCR基礎上加入螢光標記探針或相應的螢光染料來實現其定量功能的。其原理： 隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累計，螢光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一個螢光強度信號，這樣我們就可以通過螢光強度變化監測 產物量的變化，從而得到一條螢光擴增曲線圖。

螢光定量PCR的應用

分子生物學研究

1.核酸定量分析。 對傳染性疾病進行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的檢測 , 比如近期流行的甲型H1N1流感， 轉基因動植物基因拷貝數的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等。

2.基因表達差異分析。 比較經過不同處理樣本之間特定基因的表達差異 ( 如藥物處理、物理處理、化學處理等 ) ，特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA晶片或差顯結果的確證

3.SNP 檢測。檢測單核苷酸多態性對於研究個體對不同疾病的易感性或者個體對特定藥物的不同反應有著重要的意義，因分子信標結構的巧妙性，一旦SNP 的序列信息是已知的，採用這種技術進行高通量的 SNP 檢測將會變得簡單而準確。

4.甲基化檢測。甲基化同人類的許多疾病有關，特別是癌症， Laird 報導了一種稱作 Methylight的技術，在擴增之前先處理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，用特異性的引物和 Taqman探針來區分甲基化和非甲基化的 DNA ，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。

醫學研究

5.產前診斷：人們對遺傳性物質改變引起的遺傳性疾病還無法治療，到目前為止，還只能只能通過產前監測，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發生，如為減少 X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實時螢光定量PCR檢測其Y性別決定區基因是一種無創傷性的方法，易為孕婦所接受。

6.病原體檢測：採用螢光定量PCR檢測技術可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、 結核分枝桿菌、EB病毒和巨細胞病毒等病原體進行定量測定。與傳統的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優點。

7.藥物療效考核：對B型肝炎病毒 (HBV)、C型肝炎病毒 (HCV) 定量分析顯示：病毒量與某些藥物的療效關係。HCV高水平表達，幹擾素治療作用不敏感，而HCV低滴度，幹擾素作用敏感;在拉米夫定治療過程中，HBV- DNA的血清含量曾有下降，隨後若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發生變異。

8.腫瘤基因檢測：儘管腫瘤發病的機理尚未清楚，但相關基因發生突變是致癌性轉變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的表達增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出 現。實時螢光定量 PCR不但能有效地檢測到基因的突變，而且可以準確檢測癌基因的表達量。目前用此方法進行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細胞性白血病WT1基因、腫瘤 ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關的病毒基因等多種基因的表達檢測。

菲優特檢測生物團隊擁有專業的實驗室、先進的實驗設備和經驗豐富的科研技術人員。技術團隊主要致力於基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學、生物化學、病理檢測、基因檢測等技術在科研中的應用與推廣。通過高度細分、全方位的服務平臺，為廣大客戶提供了完善的技術解決方案和服務，全程跟進，確保滿意。

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  • 實時螢光定量PCR技術
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    螢光閾值 threshold以PCR反應的前15個循環的螢光信號作為螢光本底信號，一般螢光域值定義為3-15個循環的螢光信號的標準偏差的10倍。Ct值Ct值：也稱循環閾值。是指在PCR循環過程中，螢光信號開始由本底進入指數增長階段的拐點所對應的循環次數。在實際操作中，這個時刻也就是每個反應管內的螢光信號到達設定的域值的時刻，Ct值取決於閾值。Ct值與起始模板的關係：研究表明，在指數擴增期，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數成反比。螢光定量檢測常用的檢測模式有TaqMan 探針和SYBR Green I檢測模式。
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