螢光定量PCR檢測知多少

2021-02-20 陽光融和檢驗科

螢光閾值 threshold

以PCR反應的前15個循環的螢光信號作為螢光本底信號，一般螢光域值定義為3-15個循環的螢光信號的標準偏差的10倍。

Ct值

Ct值：也稱循環閾值。是指在PCR循環過程中，螢光信號開始由本底進入指數增長階段的拐點所對應的循環次數。在實際操作中，這個時刻也就是每個反應管內的螢光信號到達設定的域值的時刻，Ct值取決於閾值。

Ct值與起始模板的關係：

研究表明，在指數擴增期，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數成反比。

螢光定量檢測常用的檢測模式有TaqMan 探針和SYBR Green I檢測模式。

（1）TaqMan 探針法作用原理

本方法的原理主要是利用 Taq 酶的5 ′→3 ′外切核酸酶活性，並在PCR反應體系中，加入一個螢光標記探針。

TaqMan 探針根據其 3′端標記的螢光猝滅基團的不同分為兩種: 常 TaqMan 探針和 TaqMan MGB 探針。

（2）SYBR Green I 螢光染料法作用原理

SYBR Green I 是一種只與雙鏈 DNA 特異結合的染料 ,當它與 DNA 雙鏈結合時 ,發出螢光 ;從 DNA 雙鏈上釋放出來時 ,螢光信號急劇減弱。因此 ,在一個體系內 ,其信號強度代表了雙鏈 DNA 分子的數量。

雙鏈DNA結合螢光染料的優點：實驗設計簡單，不需要設計探針，僅需要1對引物，檢驗反應特異性，可進行曲線分析。

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