lncRNA研究策略之RNA Pull-down實驗問答

2020-12-06 生物谷

長鏈非編碼RNA(longnoncodingRNA，lncRNA)是一類不編碼蛋白的RNA分子，長度在200bp以上；研究表明，lncRNA具有保守的二級結構，可以與蛋白、DNA和RNA相互作用，參與多種生物學過程的調控。隨著高通量測序技術的發展，越來越多的lncRNA被注釋，但是絕大多數的lncRNA的功能仍然不清楚，因此lncRNA的研究是一片非常廣闊的未知領域，具有極大的科研價值和意義。其中RNAPull-down技術為lncRNA生物學功能的驗證起到了至關重要的作用。

RNAPull-down結合了體外轉錄與生物素標記、質譜技術，是研究非編碼RNA與蛋白質相互作用的一大利器。由於實驗程序較多、RNA的易降解性，加上一些不可預知的變量，因此實驗存在一些難度，常常導致實驗的失敗。對於試驗中常常出現的棘手的問題，金開瑞經過實踐，總結了一套行之有效的應對方策，現在就和我們一起來看看吧！

1、RNAPull-down拉下蛋白PAGE電泳銀染條帶顏色淺且模糊？

①選取的組織或細胞樣品其中互作蛋白表達量很低；

②體外轉錄得到的RNA降解或者不是全長；

③Pull-down實驗孵育時間不長。

④其他

2、PAGE電泳銀染背景深？

①樣品雜蛋白太多；

②銀染顯色時間過長。

④其他

3、RNAPull-down拉下蛋白銀染後看不到互作蛋白：

①選取的RNA序列不對；

②樣品中沒有表達互作的蛋白質。

③互作蛋白濃度低，銀染圖肉眼觀察不到差異條帶。

④其他

更多建議：

①lncRNA序列前期驗證要完善；

②選擇相應蛋白質表達量較高的組織或細胞樣品；

③體外轉錄選擇轉錄質量高的試劑盒，操作過程避免Rnase的汙染；

④保證RNAPull-down實驗中探針標記以及探針與蛋白的結合充分進行（依據體外轉錄RNA的量，樣品裂解液蛋白濃度）；

⑤儘可能多將洗脫的蛋白電泳（同時可以避免顯色時間過長）

好啦，這次就和大家分享這麼多啦，如果您在RNAPull-down實驗中遇到困惑，可以隨時與我們取得聯繫哦，我們將及時幫您解決！

最後，祝大家實驗順利！生活愉快！

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