傻傻分不清?DNA pull-down 來啦!

2021-01-20 每日生物評論

在前面的文章中我們和大家一起學習了RNA pull-down這種實驗技術，好學且好奇心強的小編又很快發現一種和它挺像的叫做DNA pull-down的新技術，再一起來看看吧。



DNA pull-down是體外研究DNA與蛋白互作的有力工具。該技術將生物素標記的DNA片段結合在鏈黴親和素磁珠上，再與細胞核蛋白孵育，純化出與DNA片段互作的蛋白，洗滌洗脫得到的蛋白產物，做western-blot檢測特定蛋白是否與靶DNA片段結合；做質譜鑑定即可篩選出與DNA片段可能互作的蛋白信息（如具體某個或某些轉錄因子/組蛋白等）。


生物素與鏈黴親和素間的作用是目前已知強度最高的非共價作用；其中活化生物素可以在蛋白質交聯劑的介導下，與已知的幾乎所有生物大分子偶聯。因此用生物素標記核酸後，可以純化出與該核酸結合的各種生物大分子複合物。



DNA pull-down實驗首先針對靶標區域設計特異性DNA探針，探針經過脫硫生物素標記，跟偶聯在磁珠上的鏈黴親和素結合；細胞核提取物與磁珠-DNA探針孵育，作用蛋白質分子可以和DNA探針特異性結合；純化出與靶DNA片段結合的蛋白複合體，經過洗滌可以將非特異性結合蛋白質去除；最後，經洗脫液洗脫，得到目的DNA探針-蛋白質複合物，再經過Western Blot或質譜（MS）鑑定蛋白質類型。


以下為參考實驗流程，不同實驗室會有細微差異：


（1）採用基因組DNA做模板，經PCR擴增啟動子片段；（4）標記的探針利用凝膠回收試劑盒純化回收探針，並檢測探針濃度；

（5）-20℃保存，待用


（1）預先混合 5µg 生物素標記的 DNA 和 500µg 核蛋白，置於冰上；（2）取 100µl Streptavidin-agarose G 磁珠，用冰冷 PBS 洗一次，5000g 離心 30 秒；（3）將 DNA 與蛋白的混合物加到磁珠中，重懸磁珠；（5）5000g，離心 30 秒，去除上清，收集沉澱；（6）用冰冷 PBS 洗磁珠三次，5000g 離心 1 分鐘，儘可能去除上清，收集沉澱；

（7）加入 30µl 蛋白上樣緩衝液，重懸沉澱，沸水煮 10 分鐘


（1）電泳：實驗採用不連續系統蛋白質SDS-PAGE，濃度為5%濃縮膠和8~12%濃度分離膠；每孔上樣40~60ug總蛋白，開始電壓為100v,到達分離膠後調為120v；（2）轉膜：轉膜為恆流轉膜，電流為200mA，時間根據目的蛋白分子量選擇60~120min。（3）封閉：蛋白膜放置到TBST溶液中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉膜液；加入5%脫脂奶粉封閉液，室溫50rpm，封閉60分鐘。（4）孵育一抗：根據蛋白Marker指示將PVDF膜剪開，參考一抗濃度；將PVDF膜分別放入含各自一抗溶液中，4度孵育一抗過夜，然後放入TBST洗滌液，搖動洗滌3次，每次15min。（5）孵育二抗：參考二抗濃度，按比例稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗。將PVDF膜加入稀釋好的二抗，室溫搖動孵育1h；放入TBST洗滌液，搖動洗滌3次，每次15min。

（6）顯色：使用化學發光試劑，黑暗處顯色，用X光片壓片，顯影液及定影液洗片。


（1）切膠：用刀片切取膠粒（膠粒直徑1-2mm），置於1.5ml EP管中。（2）清洗：用200ul MilliQ震蕩清洗2次，每次10分鐘。（3）脫色：對於考染膠，加考染膠色液（25mM NH4HCO3， 50% ACN）200ul，37℃ 20分鐘或超聲脫色5分鐘，吸乾，重複脫色2-3次，至藍色褪去。（4）脫水：加ACN 100ul脫水至膠粒變白，吸棄ACN。（5）清洗：用200ul MilliQ震蕩清洗2次，每次10分鐘；然後用200ul 50% ACN震蕩清洗2次，每次10分鐘。（6）脫水：加ACN 100ul 脫水至膠粒變白，吸棄ACN。（7）用25mM NH4HCO3稀釋Trypsin 至12.5mg/ml，每管加10ul，稍微離心一下，讓酶液與膠粒充分接觸，4℃放置30min ，待酶液被膠粒完全吸收，吸棄多餘的酶液，加25mM NH4HCO3 20ul，37℃過夜(16h)。（8）質譜樣品使用德國Bruker公司的Ultraflex III質譜儀開展分析，參數設置：反射模式；（14）使用標準Maker峰作為外標校正質譜峰，正離子譜測定，測定範圍控制在700-4000；（15）樣品的肽質量指紋圖譜，胰酶自降解峰和汙染物質的峰自動剔除；

（16）利用LIFT軟體將PMF強度最大的5個峰進行串級質譜分析（峰強度大於300）。


DNA-pull dwon模式圖如下所示：





額，好像跟RNA pull-down確實很像，就是RNA換成了DNA，檢測的對象就變成了DNA與蛋白的互做。那麼它有哪些應用呢？



核酸與蛋白質的互作是細胞功能的核心，包括蛋白質合成、mRNA組裝等生命活動中重要的代謝過程，研究核酸與蛋白質的互作是研究生命科學的基本工具。DNA pull-down主要用於目的DNA片段的互作蛋白（如轉錄因子等）篩選。


ok，今天就到這裡啦~~下次再給大家介紹其他相關技術


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