蛋白互作專題GST pull-down

2020-12-05 武漢普健生物

蛋白互作專題GST pull-down

蛋白功能已成為當下研究的熱點之一，蛋白間相互作用在細胞的生命活動中起著關鍵作用。相互作用的蛋白之間通過形成複雜的功能性複合體，參與細胞內一系列的信號級聯反應，從而調控細胞及個體的生命活動。研究蛋白間相互作用的常用方法有：酵母雙雜、雙分子螢光互補、免疫共沉澱和GST pull-down等。

GST pull-down技術是在GST融合蛋白的基礎上發展起來的，GST能與穀胱甘肽特異性結合，其作為表達標籤蛋白，能促進原核表達蛋白的正確摺疊及可溶性表達，現被廣泛用於體外驗證蛋白間的直接相互作用。

普健生物可以提供從GST融合蛋白製備到GST pull-down的一站式服務。普健生物還可提供Biacore、SPR等技術分析分子間的相互作用，可滿足您的不同需求。

技術原理

①獲得帶有GST標籤的融合蛋白；②將帶有GST標籤的融合蛋白親和到穀胱甘肽層析柱上；③獲取可能與融合蛋白發生相互作用的蛋白；④與融合蛋白發生相互作用的蛋白被親和到穀胱甘肽層析柱上；⑤切掉標籤，洗脫得到相互作用的蛋白。

應用

GST pull-down技術主要在體外驗證兩種蛋白之間是否存在直接的相互作用，其用途主要有兩個方面：一是證實兩種已知蛋白之間可能存在的相互作用；二是用於尋找能與已知的蛋白發生相互作用的未知蛋白。

注意問題

GST pull-down技術在體外驗證蛋白間直接的相互作用時有較強的特異性，但其存在一定的局限性，不能用於大規模的蛋白間相互作用的篩查；內源性蛋白的幹擾使實驗結果出現假陽性。

如何減少假陽性的出現，實驗操作就很關鍵了。

1. 高純度GST融合蛋白（一般傾向於可溶性融合蛋白）

1.1載體——載體的選擇對融合蛋白的表達有較大影響，pGEX載體所帶的GST標籤能夠增強下遊蛋白的可溶性表達，使融合蛋白易於表達純化。該載體經過不斷改造，已有不同亞型可以滿足實驗需求。

1.2表達條件——誘導溫度、誘導劑濃度、誘導時間。

誘導溫度：不同溫度下融合蛋白的存在形式不一。高溫誘導適用於溫度敏感型表達載體，溫度敏感型的突變體要在42℃時才會發生轉錄作用。多數情況下是在低溫下獲得可溶性蛋白，目前研究來看，最佳誘導溫度一般集中在20-30℃。

誘導劑濃度：誘導pGEX系列載體表達時所用的誘導物多為IPTG，因其不會被細菌代謝而保持穩定的濃度，而被廣泛選用。因其具有細胞毒性，使用時濃度不宜過高。

誘導時間：分為加入誘導物的時機和加入誘導物後的誘導時間。加入誘導物的時機，一般選擇在細菌生長的對數期（菌液吸光值A600=0.6~0.8）。加入誘導物後的誘導時間是根據誘導溫度來確定的，一般誘導溫度高，誘導表達的時間就短些。

2. GST標籤對實驗結果的影響

GST標籤可能會影響蛋白的正確摺疊，雖然大多數情況下不會造成影響。因此對融合蛋白

進行質量控制，會使實驗結果更加可信。如核磁共振檢測、X射線晶體分析法、功能驗證等。

3. DNA和RNA對實驗結果的影響

儘管在實驗過程中，有時會加入核酸酶來消除可能橋接到蛋白上的DNA和RNA，有可能會導致蛋白間相互作用出現假陽性。

目前蛋白間相互作用的研究方法已經取得長足發展，由於生理條件下蛋白間相互作用的複雜性，現在的任何一種方法都不能將之完全闡釋明白，在常規的生物化學法的基礎上需要聯合應用生物物理學、生物信息學等方法。

除了GST pull-down，普健生物還可提供Biacore、SPR等技術分析分子間的相互作用，在蛋白功能研究中助您一臂之力。此外，我們蛋白表達經驗豐富，體系成熟，可滿足您的不同需求。

附：研究蛋白互作資料庫

1. MINT

Licata L, Briganti L, Peluso D, et al. MINT, the molecular interaction database: 2012 update[J]. Nucleic acids research, 2011, 40(D1): D857-D861.

2. STRING

Szklarczyk D, Morris J H, Cook H, et al. The STRING database in 2017: quality-controlled proteinprotein association networks, made broadly accessible[J]. Nucleic acids research, 2017, 45(D1): D362-D368.

3. HPRO

Prasad, T. S. K. et al. (2009) Human Protein Reference Database - 2009 Update. Nucleic Acids Research. 37, D767-72.

4. BioGRID

Chatraryamontri A, Oughtred R, BoucherL, et al. The BioGRID interaction database: 2017 update[J]. Nucleic acids research, 2017, 45(D1): D369-D379.

5. DIPOS

Database of Interacting Proteins in Oryza SativaSapkota A, Liu X, Zhao X M, et al. DIPOS: database of interacting proteins in Oryza sativa[J]. Molecular BioSystems, 2011, 7(9): 2615-2621.

6. DIP Database site

Salwinski L, Miller CS, Smith AJ, Pettit FK, Bowie JU, Eisenberg D. (2004) The Database of Interacting Proteins: 2004 update. NAR 32:D449-51.

7.PPIM

Zhu G, Wu A, Xu X J, et al. PPIM: A ProteinProtein Interaction Database for Maize[J]. Plant Physiology, 2016, 170(2):618.

8. The Arabidopsis Interactions Viewer

9.PIPs

McDowall, MD, Scott, MS and Barton, GJ PIPs: Human protein-protein interactions prediction database Nucleic Acids Research 37:D651-D656 2009.

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