RNA-蛋白互作技術知多少

2021-01-19 universebiologygirl

RNA在基因表達調控中的作用已經毋庸置疑,尤其是佔人類基因組95%的非編碼RNA，其通過RNA-蛋白複合物的形式行使功能,如染色質修飾複合物,轉錄因子和RNP複合物。RNA蛋白結合是目前lncRNA研究的重要機制方向，而且是高分文章的標配。因此,研究人員開發了多種鑑定lncRNA-蛋白質相互作用的技術,用於揭示lncRNA在生物學過程中的調控機理。下面讓我們一起看下目前有哪些研究RNA-蛋白互作技術吧！



從已知lncRNA找結合蛋白的實驗方法主要是RNA pulldown，類似GST-pulldown，用帶有生物素biotin的RNA探針來捕獲lncRNA，然後用鏈黴親和素（Streptavidin）的beads結合biotin，如此親和層析後，換溶液洗脫下來的蛋白，可用質譜鑑定或WB驗證。RNA-pulldown實驗是在體外初步對RNA和蛋白質的相互作用進行鑑定的方法。通常用於發現與已知RNA結合的未知蛋白質分子。

                圖1.RNA pulldown技術流程


2. RIP (RNA Immunoprecipitation)


從已知蛋白找lncRNA的實驗方法採用RIP，類似ChIP，用ProteinA的beads偶聯抗體，抗體結合蛋白，蛋白把RNA沉澱下來，然後以測序/基因晶片高通量進行篩選，或用定量PCR進行驗證。RIP下遊結合微陣列和高通量測序技術被稱為RIP-Chip和RIP-seq。RIP-Chip技術的缺點是識別特異性較差,解析度較低,因此應用範圍有限。而RIP技術與高通量測序的結合，能幫助研究人員更好全面了解感興趣蛋白結合的RNA以及變化。


                     

                              圖2.RIP實驗流程


3. ChIRP 和 CHART


ChIRP (chromatin isolation by RNA purification)和CHART (capture hybridization analysis of RNA targets)都是基於同樣的理念，將與目標RNA互補的寡核苷酸進行生物素標記，並由此捕獲相關蛋白。之後研究者可以通過二代測序或質譜分析，來鑑定與RNA互作的蛋白，明確發生這些互作的基因組區域。但兩者主要的不同在於lncRNA靶標探針的設計,ChIRP採用lncRNA序列全長覆蓋探針設計,靶向所有潛在位點,探針的設計是簡單的RNA序列,無需事先知道RNA的結構或功能域的知識，而CHART使用的互補核酸探針數量較少，序列較長，通常需要通過RNaseH試驗尋找合適的靶標位點來設計探針。

              

                         圖3.ChIRP技術流程



CLIP（UV-crosslinking and immunoprecipitation）技術能揭示RNA 結合蛋白質在體內的RNA結合位點。其技術優勢在於能捕獲體內原位蛋白質和RNA的相互作用,紫外交聯的複合物能通過嚴格的純化,因此實驗結果更為真實可靠。但CLIP實驗因紫外交聯的效率低(1%-5%)、易受非特異RNA汙染、實驗步驟複雜和RNA容易降解等因素的影響,使用受到限制。



針對以上CLIP技術的不足研究人員開發了提高紫外交聯效率的PAR-CLIP 技術。這個方法中最重要的一點就是依賴了具有光活性的核糖核苷類似物，例如4-硫尿核苷，在活體細胞中將其插入到新生RNA轉錄本中。在365nm紫外燈輻射的細胞中，光活性的核糖核標記的RNA被誘導與RBP相互作用。免疫共沉澱所要的RBP，然後分離被交聯和共沉澱的RNA。RNA隨即被轉換成cDNA文庫並且進行深入測序。當使用4-硫尿核苷時，交聯的序列將會產生T-C的轉變，因此通過PAR-CLIP所準備的cDNA文庫能夠準確的定位交聯的位置。


                               

                  圖4.PAR-CLIP流程



RNA-蛋白複合物驅動了幾乎所有細胞過程的基因表達的轉錄後調控，包括剪接（splicing）、出核轉運（nuclear export）、mRNA 穩定性以及蛋白轉譯過程，因此，對基因調控的了解就有賴於確定這些過程中RNA的結合的變化。因此，RNA研究也被越來越多的科學家重視起來，目前已經成為生命科學研究中一個炙手可熱的領域。近年來，研究RNA蛋白結合的改進新方法也是層出不窮，以上是現在比較常見的RNA-蛋白研究的技術方法，這裡給出總結表，希望能幫助到相關研究的童鞋們。


              圖5.RNA-蛋白互作技術


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