【方法篇】研究RNA互作結合蛋白（RBPs）的方法

2020-08-27 AIMS生物

由於RNA結合蛋白（RBPs）顯著的生物學功能，它們的表達情況和活性狀態能否提供細胞系統的諸多信息。科學家們最近開發了一種新的技術手段，可稱為相互作用體捕獲手段，用於識別細胞中的活性RBPs。利用紫外線交聯RBPs與RNA聚合物，並通過寡聚dT磁珠共價結合蛋白質。經過清洗後，再通過質譜檢測結合蛋白。此實驗方法大概耗時3天，並且該方法可以用在不同生物狀態下，包括代謝、細胞周期、分化、發育或者對藥物的反應等。

已經有許多方法用於研究mRNA相互作用蛋白，例如採用全基因組矩陣和螢光RNA探針對酵母RBPs進行系統的鑑定。當然採用固定化的RNA探針作為誘餌，在體外捕獲特定的RBPs，然後在對其進行質譜檢測。

然而，這些方法不能區分活細胞中發生的RBPs和非生理狀態下的RNA-蛋白結合體。

因此有科學家開發了相互作用體捕獲技術來克服這些限制，結合紫外線交聯和Oligo（dT）捕獲技術來獲取活細胞中RBPs。

實驗方法流程

為了在體內將RBPs和RNA共價偶聯，單層細胞在254nm紫外光照射下，將Phe、Trp、Tyr、Cys、Lys等胺基酸與核苷酸發生交聯，同時也應用了光活化核苷酸4-硫代嘌呤增強交聯效果。這種核苷酸類似物被細胞吸收並用於合成新的RNA。在365nm的紫外光處理下可誘導蛋白質與RNA發生交聯。細胞裂解之後，利用寡聚（dT）磁珠捕獲聚腺苷酸RNA。經過清洗之後，與polyA+RNA結合的RBPs經過RNase處理後釋放，隨後對其進行質譜鑑定。


圖1



實驗設計

設置對照組

設置一個對照組，區別於UV紫外線輻射組，為了區別出寡聚（dT）結合的汙染物，以及磁珠非特異性結合的蛋白質。

UV cross-linking

0.15Jcm-2對於細胞Hela、Huh-7和HEK293在254nm（cCL）和365nm（PAR-CL）紫外線照射下最優劑量，當然如果選擇其他的細胞則需要進行條件優化。

4SU incorporation

4SU對於Hela、Huh-7和HEK293細胞的最佳處理濃度是100μM，其他的不同細胞處理濃度也需要進行優化。細胞交匯狀態下或者增值較慢的細胞需要較高濃度的4SU或者較長的孵育時間，以便將核苷酸類似物4SU充分進入RNA中。

Celllysis

對細胞進行適當的裂解是RBPs捕獲過程中最關鍵的步驟之一，並且需要對其進行優化。裂解緩衝液處理後通常會粘度變高，但是如果粘度較高，汙染物會被困在親和珠子中，影響mRNA分離的純度。當細胞裂解液在均質化後仍然非常緻密時，我們建議增加裂解液緩衝液的體積，促使裂解液更好的進行均一化。

Bead recycling

為了控制試劑成本，polyA RNA的捕獲過程分為三個連續的循環，並可重複使用相同的珠子。

如果使用的親和磁珠數量不能有效地完全富集細胞的mRNA，那麼可以在後續實驗增加親和磁珠數量或者分離次數。

Proteomics

我們在進行液質聯用平臺上進行蛋白質組分析，為較大程度的提高蛋白鑑定的深度，可以通過等電點聚焦技術對胰蛋白酶消化後的樣本進行肽段分餾來降低樣本複雜性，然後通過高分辨LC-MS/MS進行分析。其中關鍵的一點是分析實驗組和陰性對照組中所鑑定蛋白的情況，並且此實驗方法也可以適用於穩定同位素標記實驗例如，SILAC和iTRAQ。

HPLC and MS parameters

應對所用液相和質譜進行優化，以最大限度地增加有效肽段鑑定的數量，通常質譜平臺或者質譜服務公司都對其進行優化，不需要做特定的調整，需要注意的是，所有樣本必須（包括陰性對照）都需要在相同的條件下進行分析。

Statistical data analysis

建議對樣本進行設置生物學重複，樣本組和對照組都是以一式三份進行分析測試，然後可以對分析的離子信息值進行t檢驗統計分析。

方法優點

此種實驗方法與之前的方法有諸多優點：

  1. 在紫外光照射下，只有緊密接觸的蛋白與RNA才能有效的形成交聯反應。
  2. 紫外光直接作用於單層細胞，從而「凍結」了細胞內蛋白質與RNA的相互作用狀態。
  3. 核苷酸雜交（polyA-olgodT）的結合是穩定的，因此能排除多聚肽段與RNA非共價結合或者蛋白與蛋白相互作用的影響。
  4. 通過此方法獲取RBPs也可以用來做蛋白質組相對定量。
  5. 在不同的生物系統或者實驗條件下，此捕獲實驗方法也可以用來研究RBPs組成和動力學研究。

方法限制

缺點主要有如下：

  1. 不能檢測未結合到PolyA+RNA的蛋白質；
  2. 不能研究未在細胞中表達的蛋白；
  3. 不能檢測在當前實驗條件下有活性的蛋白；
  4. 未在紫外線下發生交聯的蛋白，因紫外線交聯效率一定，因此需要足夠多的細胞下進行，例如2.8×108的細胞。

方法應用

RBPs的捕獲可以通過小範圍實驗和WB檢測感興趣蛋白在體內與RNA結合情況，並通過質譜對RBPs進行分析。

該方法最初應用於Hela細胞中，現在可以應用於其他類型細胞（如幹細胞），並適用於組織和單細胞或者多細胞。

另外還對此方法在其他領域應用進行了展望，作為檢測RBPs對不同環境條件、刺激、治療（如飢餓、缺氧、白細胞介素刺激、藥物因素）或者發育和分化階段的動態響應手段。

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