Attana Cell 200蛋白互作分析儀，生物大分子結合動力學研究工具

2020-08-27 澤平科技

瑞典Attana公司製造的Attana Cell 200蛋白互作分析儀，是一種無需標記、可直接在細胞表面測量分子相互作用的生物傳感器，其填補了傳統生物傳感器與基於細胞的分析方法之間的空白。

Attana蛋白互作分析儀依託於石英晶體微天平（Quartz Crystal Microbalance，簡稱QCM）技術，外加的交流電勢使石英晶體在共振頻率下震動，當分子流經晶體並與表面結合，振動頻率會發生變化，其頻率差異可以用來反映實時的分子相互作用。

自2010年上市以來，Attana Cell 200蛋白互作分析儀已廣泛用於蛋白互作、蛋白細胞互作、抗體藥研發等領域，贏得了包括大學、藥企、CRO實驗室的信任，與製藥化工巨頭Lonza集團、胰島素研發明星諾和諾德等長期合作。

相比傳統分子互作檢測技術，Attana開創了直接在細胞層面進行實時原位分子結合動力學的檢測方法，更準確地反映了體內環境的分子間互作，能夠高質量、精確地研究其特異性、動力學和親和力。

Attana Cell 200蛋白互作分析儀檢測內容

蛋白與細胞的相互作用

蛋白與組織切片的相互作用

細胞與細胞的相互作用

可使用粗製蛋白樣品

Attana蛋白互作分析儀應用實例

用QCM技術檢測蛋白藥物與腫瘤組織切片的結合動力學

長久以來，將癌症組織用甲醛固定石蠟包埋（FFPE）後做組織切片，進行免疫組化（IHC）分析，是癌症相關抗原的標準檢測方法。但免疫組化本身很難定量抗體與癌症相關抗原結合的特異性和親和力。Clausen等人建立了一套以Attana Cell 200 QCM技術為核心，直接在組織切片上進行實時原位分子結合動力學的檢測方法。

研究者直接在FFPE人胎盤組織、乳腺癌和前列腺腫瘤標本中，測定了rVAR2蛋白與它的胎盤樣硫酸軟骨素（pl-CS）受體之間的相互作用，發現rVAR2與FFPE人胎盤、腫瘤組織存在納摩爾級的親和力，與pl-CS陰性的正常組織無相互作用。

進一步用雄激素受體N-20的抗體（抗AR）對此方法進行評估，發現Attana得出的KD值與可用抗原表位的數量無關，表明Attana不僅能在組織標本上直接對抗原-抗體結合親和力進行定量，還能評估抗體所能識別的抗原表位的數量。

基於這些結果，研究者認為Attana QCM技術不僅可用於挑選診斷和治療中的最佳生物製劑，還能用於開發新型高親和力的藥物。

（Clausen, T. M., et al. Real-time and label free determination of ligand binding-kinetics to primary cancer tissue specimens; a novel tool for the assessment of biomarker targeting. Sens Biosensing Res. 2016; 9: 23-30.）

圖1.Attana Cell 200蛋白互作分析儀與COP-1檢測晶片。

圖2.免疫組化鑑定為陽性的甲醛固定石蠟包埋組織樣品被切成5μm厚的薄片，並固定在COP-1晶片中心。

圖3.（b）Attana測定出rVAR2蛋白與胎盤組織的KD值為4.27nM，具有高親和力。（c）當添加了能抑制rVAR2粘附於胎盤組織的CSA溶液後，rVAR2蛋白與胎盤組織的結合曲線不再有明顯的結合點和解離點。

圖4.（a）免疫組化結果顯示，與作為正常組織對照的扁桃體組織切片相比，rVAR2蛋白與乳腺癌、前列腺腫瘤組織切片有強相互作用，進一步用Attana測定其KD值分別為8.9nM和6.65nM，而與扁桃體組織的結合曲線無明顯的結合點和解離點，無法測出其KD值。（b和c）用V5-FITC的抗體對rVAR2蛋白進行定位，進一步驗證了Attana得到的結果，即rVAR2蛋白與前列腺腫瘤組織切片強結合，而不與扁桃體組織結合。證明Attana能準確對組織切片上抗原-抗體的親和力進行定性和定量。

圖5.檢測發現純化的胎盤樣硫酸軟骨素（pl-CS）受體與rVAR2蛋白的KD值為3.6nM，具有強結合，證明Attana可準確檢測純化蛋白間的相互作用。

圖6.將乳腺癌細胞(SKBR3)、前列腺癌細胞(LNCap)與中國倉鼠卵巢細胞（CHO）相比，免疫組化和Attana的結果一致，乳腺癌細胞與前列腺癌細胞均檢測到細胞與rVAR2蛋白有著很強的親和力。

圖7.高表達AR的Lncap細胞與AR抗體有強的親和力，而雄激素非依賴的PC3與AR抗體的親和力相對較弱。這一結果進一步在細胞水平上證明了Attana具有廣泛的兼容性。

圖8.採用Attana對AR抗體與FFPE組織切片的親和力檢測結果，與免疫組化結果一致，即免疫組化陽性的FFPE前列腺癌組織，對AR抗體有強的親和力，免疫組化陰性的FFPE胎盤組織，對AR抗體無相互作用。這一結果在組織切片水平上也證明了Attana能有效監測抗體與切片的結合。

實驗總結：

1、組織切片如何固定在COP-1晶片上

Attana的COP-1晶片在室溫用聚L-賴氨酸溶液包被5分鐘。包被後，用PBST衝洗晶片，並在室溫乾燥2小時。將甲醛固定石蠟包埋（FFPE）組織樣品切成5μm厚的薄片，並貼在晶片上，60℃烘烤1h。

2、脫蠟和抗原修復

將COP-1晶片上的組織樣品浸沒在EZprep溶液中，65℃水浴30min進行脫蠟。之後PBS洗3次。再在95℃下，用pH6.0的10mM檸檬酸鈉、0.05％吐溫溶液浸泡30min進行抗原修復。

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