撰文 | 章臺柳
細胞產生大量的蛋白質複合物，這些複合物參與調節幾乎所有的生物功能。例如，最近在後生動物的全蛋白質組研究中發現了1000種不同的多蛋白複合物【1】，而這個數字可能也是被低估的。隨著越來越敏感的蛋白質組學和電子顯微鏡技術，蛋白質複合物的鑑定和結構表徵正在迅速加快，使得接近自然條件下的高通量分析成為可能。與此相比，由於缺乏合適的高通量方法，絕大多數蛋白質複合物的生物發生和動力學的表徵較差。經典的體外重組策略雖然在破譯蛋白質複合物的功能方面非常成功，但一次通常只適用於少數蛋白質。另一方面，自上而下的遺傳方法在識別相關的分子參與者方面具有強大的能力，但不能從引入變化導致的間接結果中辨別直接影響。即使將這些策略結合在一起，也無法輕鬆解決一些關鍵問題，如組裝動力學或結構成熟過程的順序。
核孔複合物（NPC）是真核細胞中最複雜的蛋白質結構之一，由500到1000個核孔蛋白（NUPs）組成分子質量為50-100MDa的蛋白結構。近年來，遺傳、生物化學和高解析度結構技術已經成功研究了NPC的結構組成（裡程碑丨施一公團隊解析核孔複合物近原子解析度胞質環結構及高解析度原位核孔複合物腔環結構）【2】，但其生物發生的關鍵細節尚不清楚，這或與NPC的巨大分子量、與脂膜相關以及其在基因表達的中心作用造成研究的障礙有關。
近日，來自蘇黎世聯邦理工學院的 Karsten Weis和 Evgeny Onischenko 在Cell雜誌上發表文章 Maturation Kinetics of a Multiprotein Complex Revealed by Metabolic Labeling，開發出高通量分析蛋白複合物的天然組裝動力學的策略，並對酵母中320對核孔蛋白NUPs組成約50MDa核孔複合物的組裝過程進行表徵。發現一些NUPs通過迅速的交換，共組裝發生較快；一些需要較長的成熟步驟。揭示出NPC生物發生過程中的層次性原則，即單個的亞複合物在1分鐘的時間尺度上形成，然後需要1小時的成熟過程才能完成從中心到外圍的共同組裝。
蛋白質複合物的形成可以看作一個代謝過程，首先從較小的區塊（胺基酸）合成新的蛋白質，然後通過一系列的成熟中間產物（包括摺疊和多亞基組裝步驟）進行處理，最終形成成熟複合物。基於此，研究人員開發出KARMA（kinetic analysis of incorporation rates in macromolecular assemblies）技術，首先將目標複合物的一個蛋白組分使用親和力標記（「誘餌」），新和成的蛋白質在活躍生長的細胞中使用SILAC（細胞培養中使用胺基酸進行穩定同位素標記）進行脈衝標記。標記的蛋白在標記後的幾個時間點使用親和力pull-down進行分離，確保檢測到與「誘餌」結合的複合物成分（「獵物」）。對於每個時間點，分析的複合物使用質譜分析，計算每個獵物的同位素蛋白質標記的範圍。
由於結構成熟過程，獵物蛋白質中同位素標記的出現不可避免會延遲。為了使用一個定量的框架將KARMA中觀察到的標記動力學與成熟過程中的組裝時間聯繫起來，研究人員開發了一個簡單的動力學狀態模型（KSM），類似於用於分析代謝通量的模型。KSM描述了在細胞生長中，同位素標記的胺基酸蛋白質複合物成熟過程中的傳播過程，因為他們與獵物蛋白結合在一起，並伴隨著不同的成熟狀態。最簡單的情況就是，胺基酸從成熟狀態（S1，新生成的獵物蛋白質摺疊或與其他成分結合）過渡到成熟狀態（S2，獵物蛋白與誘餌共同組裝，產生最終的KARMA讀數），即不可逆的2步裝配過程。而其他因素，如獵物蛋白的動態交換、降解或胺基酸的更新，可以通過引入額外的KSM狀態和通量進行解釋。同時，這些也適用於那些可以可逆地分離和在複合物之間動態交換的蛋白質，這些蛋白質的標記動力學可通過向KSM中添加反向通量來表示，並且模擬穩定結合的蛋白質，即可逆的2步裝配過程。
利用複合物的不同結構組分作為親和力誘餌進行KARMA分析時，在一個有序成熟過程中，當誘餌位於給定獵物的較遠的下遊時，預期會觀察到一個更大的有效成熟庫（effective maturation pool，EMP）。通過提供成熟狀態下蛋白質組分的估計，EMP給出了給定獵物蛋白質相對於不同誘餌的成熟過程的長度，其中更下遊的誘餌將產生更高的EMPs。這種動態讀數為成熟過程中的多個誘餌-獵物的配對提供相似性的衡量，可以用來描繪結構性生物發生事件的順序和事件。
為了驗證KARMA的可行性以及實用性，研究人員在活躍生長的酵母細胞中對320對NUPs的共同組裝動力學以及NPC的生物發生進行研究，描繪了NPC生物發生的天然順序和時間。NUPs首先形成亞複合物，然後有層次地組裝形成從中心到外周的結構。NPC成熟過程中，單個的NUPs的處理速度具有非常大的差異，範圍從幾分鐘到1小時；並且組裝到NPCs中的機制也不相同，一些通過動態交換，一些通過費時的成熟過程轉變。
總的來說，研究發現了NPC生物生成的中心原則，並證明了使用代謝標記來表徵大分子複合物的動力學方法（KARMA）的強大功用，為研究多蛋白組裝的細胞內動力學提供新工具。
原文連結：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.11.001
參考文獻
1. Heusel, M., Bludau, I., Rosenberger, G., Hafen, R., Frank, M., Banaei-Esfahani, A., van Drogen, A., Collins, B.C., Gstaiger, M., and Aebersold, R. (2019). Com- plex-centric proteome profiling by SEC-SWATH-MS. Mol. Syst. Biol.15, e8438.
2. Lin, D.H., and Hoelz, A. (2019). The Structure of the Nuclear Pore Complex (An Update). Annu. Rev. Biochem. 88, 725–783.