酪氨酸磷酸化修飾結合蛋白的富集和系統鑑定研究

2021-02-28 tjsepuweixin

摘要：我們研究了SH2（Src同源）結構域識別酪氨酸磷酸化（pTYR）殘基位點的識別特徵，發展了一種新型的帶光交聯基團的隨機多肽探針，結合質譜鑑定，研究了酪氨酸磷酸化結合蛋白的大規模鑑定。

關鍵詞：SH2結構域，磷酸化修飾，液相色譜，質譜，光交聯

特定結構域介導的蛋白質之間的相互作用，在生物體內的各種信號通路和生理調節中起重要作用。它們為測量細胞的病理狀態，識別癌症生物標誌物，發現藥物靶點提供了豐富的資源。同時，基於質譜的蛋白質組學研究方法也進一步使之成為可能。

我們設計了一種新型的帶光交聯基團的隨機多肽探針，用來大量富集酪氨酸磷酸化的結合蛋白。在本研究中，我們以含有SH2結構域的蛋白質能夠與其他蛋白質上的磷酸化酪氨酸殘基對接為模型，發展了新型的多肽-蛋白相互作用分析方法。

Enrichmentand identification of tyrosine phosphorylation binding proteins

AnJinying, Zhai Guijin, Bai Xue, Chen Cong, Tian Shanshan, Zhang Kai*

(Tianjin KeyLaboratory of Medical Epigenetics, Tianjin Medical University, Tianjin 300070）

Abstract:We described the identification of SH2 (Src homology) domain recognition bytyrosine phosphorylation (pTYR) residues sites, and how to enrich and identifythe binding proteins of tyrosine phosphorylation. We have used a new type ofrandom peptide probe with light crosslinking group, which can be used toidentify more target proteins that interact with tyrosine phosphorylation incombination with mass spectrometry.

Keywords:mass spectrometry,SH2 domain,Phosphorylation, photo crosslinking, Liquidchromatography

1實驗部分：

1.1 儀器與試劑：超高壓液相色譜-四極杆/靜電場軌道阱質譜儀（QE，美國Thermo-fisher公司），乙腈、水和甲酸（色譜純，德國Merck公司），垂直平板凝膠電泳儀（美國Bio-RAD公司）。

1.2 GST-SH2蛋白的構建與表達

我們在北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成了一個質粒，然後使用rosetta大腸桿菌表達GST-SH2蛋白，經由穀胱甘肽瓊脂糖珠純化表達蛋白。

2 結果與討論

2.1研究策略、方法

Fig 1: process ofInteraction between random peptideprobe and tyrosine phosphorylated protein

如圖1所示，探針和蛋白首先在4°C孵育過夜。然後，在冰上用紫外燈照射樣品[1]，轉移到預洗的鏈黴親和素瓊脂糖珠中，接著用洗滌緩衝液[2]去除非特異性蛋白。最後，將樣品加熱、離心，將上清液加到凝膠中，用SDS-PAGE和質譜進行分析。

2.2探針表徵

合成的探針通過MALDI-TOF質譜儀進行分子量表徵。主峰分子量與理論分子量相符，說明探針合成正確，可以用於後續實驗使用。

2.3隨機探針對目標蛋白的親和富集和質譜鑑定

圖2：隨機磷酸化探針選擇性地捕獲HeLa細胞裂解液中的蛋白。泳道1：GST-SH2和HeLa細胞裂解液。泳道2：用探針和鏈黴親和素珠富集hela細胞中的蛋白。泳道3：GST-SH2和BSA。泳道 4：用探針和鏈黴親和素珠富集GST-SH2和BSA中的蛋白。

Fig. 2.The randomprobe selectively captures binders from Hela cells. Lane 1:GST-SH2and Hela cell lysates loaded directly on the SDS gel. Lane 2: Binders isolatedfrom GST-SH2 and Hela cell Lysates by probeand streptavidinbeads. Lane 3: GST-SH2 and BSA loaded directly on the SDS gel. Lane 4:bindersisolated from GST-SH2 and BSA by probeand streptavidin 

beads.

如圖2所示，探針可以富集帶酪氨酸磷酸化修飾的結合蛋白，同時此方法具有良好的特異性和選擇性。

3 結論

這一工作為酪氨酸磷酸化修飾結合蛋白的富集和鑑定提供了新的分析策略。我們的結果表明：這一方法可以大量地鑑定酪氨酸磷酸化修飾的結合蛋白，具有相對的特異性及專一性，並且在生物醫學領域具有潛在的應用前景。

參考文獻：

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