cell:蛋白質磷酸化修飾+全外顯子捕獲測序技術的低成本研究策略

前言

蛋白質磷酸化修飾是生物體內最重要的共價修飾方式之一。蛋白質的磷酸化和去磷酸化這一可逆過程調節著包括細胞增殖、發育、分化、信號轉導、細胞凋亡、神經活動、肌肉收縮及腫瘤發生等過程在內的所有生命活動。全外顯子捕獲測序（WES）技術以其相對較低的成本而受到大多數研究者的青睞。

然而，隨著更多組學技術的出現和發展，如何充分利用高性價比的WES數據繼續保持高影響力的文章產出，已成為困擾很多研究者的問題。今天小鹿為大家整理了近期發表在Cell上的一篇極為經典的蛋白組學、磷酸化蛋白組學、WES相關的多組學聯合分析文獻，希望能助您打開思路，找到新的挖掘點。

基本信息

中文標題：人肺腺癌的綜合蛋白組學特徵

研究對象：肺腺癌病人樣本（癌組織和配對癌旁組織）

發表期刊：Cell

影響因子：38.637

發表時間：2020.07

第一作者單位：中科院上海藥物研究所

運用生物技術：蛋白組學和磷酸化蛋白組學 / 全外顯子捕獲測序（WES）/ 轉錄組

原文連結：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.05.043

文章摘要

肺腺癌(LUAD)的基因組研究提高了我們對疾病生物學的理解，加速了靶向治療。然而，目前對LUAD的蛋白質組學特性知之甚少。研究者對103例中國LUAD患者進行了全面的蛋白質組學分析。對蛋白質組、磷酸化蛋白質組、轉錄組和全外顯子組測序數據的綜合分析揭示了腫瘤相關特徵，如腫瘤相關蛋白變異、特有的蛋白質組特徵以及早期患者或EGFR和TP53突變患者的臨床結果。基於蛋白的LUAD分層顯示了三個亞型(S-I、S-II和S-III)，它們與不同的臨床和分子特徵有關。此外，研究者探究了潛在的藥物靶點，並在一個獨立隊列中驗證了HSP 90β的血漿蛋白水平作為LUAD的潛在預後生物標誌物。這項綜合蛋白組學分析使研究者對LUAD的分子結構有了更全面的了解，並為更精確的診斷和治療提供了機會。

研究思路

研究結果

1. 中國肺腺癌分子譜分析

研究者收集103份未經治療的中國肺腺癌患者的原位肺腺癌組織及其相應的癌旁組織（NAT），利用基於質譜的無標籤蛋白定量策略進行蛋白組學分析，利用TiO2富集策略對79對樣本進行磷酸化蛋白組分析，利用WES對所有成對樣本進行癌組織的基因組變異檢測，對51個腫瘤樣本和49個癌旁樣本進行RNA-seq（圖1）。通過WES測序分析，發現17,917個變異事件，與TCGA研究中EGFR突變（14%）相比，WES檢測到的EGFR突變顯著增加(50%)，而另一個致癌KRAS突變（6%）則比TCGA報導的（33%）顯著減少。對所有患者樣本進行蛋白質組學測定，共檢測到11,119個蛋白和肽組分，錯誤發現率(FDR)為1%。平均每個樣本中肺腺癌蛋白組有6,682個組分，在癌旁組織中最小為4,266個，腫瘤組織中的最大值為8655個。

圖1：肺腺癌樣本的多組學表徵

（A）實驗設計和不同組學分析的樣本數量。

（B）基因組譜圖。

（C）肺腺癌樣本的蛋白組譜圖。

（D）肺腺癌患者的磷酸化蛋白組譜圖。

利用全外顯子捕獲測序檢測到23,080個體細胞拷貝數變異(CNA)，分析了這些CNAs對mRNA、蛋白質和磷酸化蛋白表達的調控作用（圖2）。CNAs可以正向或負向影響這些組分的順式或反式表達，其中，17179 個（74.4%）CNAs影響7686 mRNA, 10530個CNAs （45.6%）影響2634個蛋白，4330個CNAs（18.8%）影響1284個磷酸化蛋白的表達。這些分析表明，轉錄組、蛋白質組和磷酸化蛋白質組具有獨特的特徵，當與基因組適當整合時，可以帶來新的見解和機會，從而發現新的功能重要的基因產物。

圖2：肺腺癌樣本的組學聯合分析

（A）CNAs對mRNA和蛋白質的功能效應。

（B）SNVs在DNA、mRNA和蛋白水平上的交疊。

（C）利用LC-MS/MS驗證的新的RNA拼接和融合轉錄本。

3. 與癌旁組織相比，癌組織的蛋白組學特徵

利用LC-MS/MS鑑定到11,119個蛋白，其中3913個在所有103個患者中被量化，5753個存在於90%以上的患者中。通過PCA分析可以將腫瘤樣本和癌旁樣本清晰地區分開，在差異表達的蛋白中，有些與臨床預後有很好的相關性。尤其是幾個前期報導過的肺部標誌性蛋白(AGER, SFTPA2, CACNA2D2LAMP3, SCGB1A1, SFTPB, and SFTPC)在腫瘤組織中低表達。並且，幾個在腫瘤中高表達肺部富集蛋白的患者顯示出更好的治療預後性。

圖3：肺腺癌中腫瘤樣本和癌旁樣本的蛋白組特徵

（A）103對肺腺癌患者樣本中8252個蛋白的PCA分析。

（B）癌和癌旁中差異表達的蛋白及其相關的生物學通路。

（C）四個生物學通路之一的代表性蛋白及其與預後的關聯。

4. 早期肺腺癌的蛋白組學特徵

基因座富集分析（GSEA）顯示與能量代謝（如脂肪酸代謝和氧化磷酸化）相關的通路在差異基因組中富集。相反，上皮間質轉化（EMT）和其他炎症和致癌信號通路（如TNF-α、mTOR和MYC）在差異蛋白組中富集（圖4）。

圖4：腫瘤淋巴結轉移（TNM）I期肺腺癌和帶有EGFR/TP53突變的肺腺癌樣本的蛋白組特徵

（A）TNM I期肺腺癌患者GSEA揭示與預後好壞相關的通路。

（B）I期患者中預後好或壞的差異表達蛋白及其在所有患者中與治療預後的相關性。

（C）病理診斷為EGFR/TP53突變和未突變的肺腺癌患者另個markers（TTF-1和NAPSA）的表達情況。

（D）EGFR突變與EGFR/TP53共突變患者的存活率分析。

5. 肺腺癌的蛋白質組亞型及其臨床結果

以1657種最易變的蛋白為基礎，共聚類鑑別出3種蛋白組亞型（S-I，S-II和S-III）。S-I組患者臨床預後結果最好，S-III最差。基因組信息顯示S-II的突變頻率最高，而S-III的腫瘤突變壓力最高，兩種marker 蛋白（TTF-1和NAPSA）在S-III患者中表達最低。WES數據的突變特徵分析在103例患者中確定了9個主要特徵，年齡特徵是其中最主要的特徵（圖5）。

圖5：肺腺癌分子亞型及其治療預後相關性。

（A）842個蛋白在三種亞型中的相對豐度。

（B）103例肺腺癌患者中三種蛋白亞型與治療預後的相關性。

（C）蛋白亞型與11種變異的相關性。

6. 磷酸化蛋白組與治療相關性

在至少50%患者中定量了1244個磷酸化蛋白質，其中，與癌旁組織相比，474個（38%）在腫瘤組織中顯著增加，183個（15%）顯著下降。三種蛋白亞型中磷酸化蛋白組學的比較結果揭示了亞型特異性的活性激酶，包括S-I型中的AKT1，S-II型中的PRKCE，S-III型中的MAPK14。進一步對差異改變的磷酸化位點的研究顯示，在S-I中觀察到參與黏附的底物升高和參與RNA轉運的底物減少（圖6）。

圖6：肺腺癌的磷酸化蛋白組特性及其與治療預後的相關性。

（A）癌或癌旁組織中磷酸化蛋白的表達。

（B）利用KSEA評估三種蛋白亞型中激酶活性。

（C）癌和癌旁組織中三個差異表達的磷酸化蛋白的鑑定。

（D）參與兩個通路的磷酸化位點及其在三種蛋白亞型和兩個與OS相關的磷酸化位點列表。（E）肺腺癌中的磷酸化調節網絡。

主要結論

(1) 發現了LUAD早期預後相關蛋白和通路；

(2) 通過蛋白質組學揭示了肺腺癌與臨床和分子特徵相關的三種亞型；

(3) 鑑定了亞型特異性激酶和癌症相關磷酸化蛋白；

(4) 解析了LUAD中潛在的預後生物標誌物和藥物靶點的識別。

參考文獻

JY Xu , CC Zhang , X Wang et al. Integrative Proteomic Characterization of Human Lung Adenocarcinoma. (2020) Cell Jul 9;182(1):245-261.e17

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文章來源於鹿明生物