背景介紹
全外顯子檢測（WES）改進了臨床遺傳病的診斷方法，其診斷率達到25-50%，然而仍然有25%-75%為陰性結果，這些陰性結果後續該怎麼辦，目前誰也不清楚。市面上有一些商業化的檢測機構提供免費的全外顯子測序重分析服務，大概能提高10-15%的診斷率，大部分（約70%）是由於新基因與疾病的關係被發現。其他一些研究發現重分析可以提高15-36%的診斷率，主要是因為使用trio測序，分析拷貝數變異（CNV），文獻報告以及案例配對平臺。對父母同時測序和新基因發現大概能提高15%的診斷率。我們自己的經驗是重分析提高診斷率是因為表型重新收集與整理、提高外顯子測序深度、重新比對、重新分析突變以及新基因發現，重新對表型進行分析採用一代測序或MLPA或長度分析可以找到被全外顯子漏掉的變異。全基因組測序由於可以檢測非編碼區、均一性的覆蓋度以及可靠地分析結構變異，也是外顯子陰性結果的選擇之一，有文獻報導可以提高約15%的診斷率，但是因為保險不覆蓋臨床上並不常用。
全外顯子檢測陰性結果有很多原因，首先是該疾病並非由單純的基因突變所導致，WES肯定是陰性結果，比如複雜性疾病，如高血壓、糖尿病、病毒感染等；其次雖然是單獨遺傳因素導致，但是突變類型是WES分析不了的，不如動態突變；最後是突變沒有被WES覆蓋到或者分析時認為與疾病不相關。這可能由以下幾個原因引起，一；分析因素/差異（如WES難分析區域，不同的質控標準）。二；首次WES檢測後的知識更新（涉及到表型，新基因在科學上被發現）。三；實驗室之間解讀與報告突變的標準不同（如有些突變沒有報告是因為與患者表型不太符合）。
未診斷的疾病網絡（Undiagnosed Diseases Network）是NIH資助的研究項目，旨在幫助那些未診斷的患者得出診斷。我們收集的這些患者都是之前經過第三方實驗室診斷為陰性結果的案例，特別有挑戰性，不僅僅是大部分患者已經做了trio全外測序，而且部分也經過了重分析仍然是陰性。因此，我們設計了一套系統的方法來解決這些案例，包括用我們的創新和不可知方法重新分析ES數據，與表型分析並行，然後反覆利用表型與基因型信息並相互驗證。
入組患者
共38名患者，平均年齡7.07±5.82歲，最多的神經系統受損合併神經肌肉問題，其次是胃腸道問題，37名患者之前進行過WES檢測，1名進行過全基因組測序檢測。大部分都是一家三口全外顯子檢測（trio）（33/38，86%），2例是一家四口全外顯子檢測，2例是父母一位與孩子全外顯子檢測，1例是單人全外顯子檢測，38例中有18例進行了重分析。
評估外顯子陰性案例的流程
我們從WES數據再分析和表型分析開始。 這些數據被迭代用於推導可以進一步用於診斷的感興趣的變異。如果再分析發現可能致病的變異，則重點查看與該變異所在基因病症相關的臨床表現。如果表型分析提示某種疾病，則WES數據針對相關基因進行重點複查，如果結果為陰性，則進行sanger測序，MLPA及生化檢測。以上都是陰性的話則進行全基因組測序。
UDN表型分析
37例患者進行了表型分析（剩餘1例在入組後去世），包括定製的臨床問診，影像學檢測，實驗室檢測。
其他相關檢測的覆核
38例患者中有36例進行了基因晶片檢測，無明確的能夠解釋患者表型的CNV，對於雜合性缺失區域，重點分析該區域有無隱性遺傳致病基因的突變位點。
WES重分析
35名患者及家屬獲得了原始測序FASTQ文件，採用DRAGEN平臺進行比對，Picard去重複，GATK分析突變，注釋採用Clin-Eff。分析流程採用創新的不可知方式，應用本小組自主開發的RVIS算法。變異分析採用兩級分析，第一級採用嚴格的質控標準，而第二級對於已報導或LOF變異採用寬鬆的質控標準，防止假陰性結果。新發突變、純合子，新的半合子變異以及複合雜合變異全都重點分析，外顯子與內含子交接處8bp及編碼區都部納入考慮，對於外顯不全和父母嵌合的情況也有特別考慮。採用ACMG標準對變異進行致病性判斷。
與實驗室溝通有關WES陰性結果
當檢測到新的變異時，我們與相關的實驗室溝通，以討論變異未被檢測到或之前未被認為致病位點的原因。相關信息見於表格1-4以及附件表格S1。
診斷的確定
基因組信息和臨床信息一起被用作診斷，考慮到罕見病的特殊性，UDN建立了診斷的4級標準。分別是明確（Certain）、非常可能（Highly Likely）、有可能（Tentative）、低可能（Low）。針對本研究，我們採用前面的三種來判斷診斷。當鑑定出新基因中的變異時，這些被歸類為候選基因。 如果進一步的途徑如GeneMatcher和功能研究導致確定它們是新的疾病基因，則將它們分類為陽性。
結果
整體上，38例有18例（47%）獲得了診斷，包括12例明確診斷，6例非常可能診斷，3例有可能診斷。5例分析出候選致病基因，總之，我們確定了26/38（68％）個人的診斷/潛在診斷具體見表1。
全外顯子重分析
8例患者（23%）獲得明確和非常可能的診斷，1例獲得有可能診斷的結果。在這9例中有1例是由於新基因被發現（EFL1）。除了案例3是由於NPHP1基因的純合缺失之外，其他突變都可以被全外顯子檢測到。
表型與基因整合分析
基因發現可能致病位點指導臨床表型收集與確認，而表型分析也可以反過來提示某些基因。例如案例1，EFL1這個位點在表型分析一開始就是檢測到的，後續指導臨床表型採集，發現這個患者還有血液學，肝臟和胰腺異常，而這與EFL1基因突變引起的類SDS症候群非常符合。相反地，案例2經過臨床專家分析需要重點分析CACNA1A基因，當手動查看這個基因時，果然發現一個可能致病位點。
表型驅動的診斷
有兩例患者由於臨床表型強烈懷疑為某具體遺傳病，目標分子診斷發現一個致病性變異而之前WES遺漏了，該位點具體見文獻報導（Looking beyond the exome: a phenotype-first approach to molecular diagnostic resolution in rare and undiagnosed diseases. Genet Med. 2018;20:464–9.）。案例17在已知致病基因上發現一個VUS位點，患者和其母親都攜帶該位點且都有表型。案例18是最近發現文獻報導一個致病性CNV，與患者表型符合。案例15和案例19由於與某遺傳病有非常接近的臨床表型，雖然沒有找到致病基因位點，但是臨床診斷是明確的。
全基因組測序
有3例（3/18，16%）通過全基因組測序獲得診斷，這三例都是由於結構變異，之前WES未檢測到在於其很難檢測分析大於15bp的缺失。
新基因與疾病被關聯
2個新的基因（ASXL2,NACC1）被科學上被明確與疾病相關，另外還有2個基因通過功能實驗、動物模型、GeneMatcher被定為候選致病基因（AGTPBP1，IRF2BPL），文章即將發表。
候選基因
我們的重分析發現4個新的候選基因，全基因組測序發現一個候選基因（TBX2），這些基因正在進行功能研究。
討論
全外顯子測序在臨床上普通應用而50-75%為陰性結果，解決全外顯子檢測陰性案例的系統方法是一個亟待解決的難題。我們的研究表明通過表型的仔細分析、結合創新的重分析流程、目標分子檢測（這裡主要指一代測序，MLPA）和全基因組測序，有47%的陰性案例得到了診斷，另外有20%的案例有了可能診斷與候選致病基因。我們的經驗表明全基因組測序對於結構變異檢測非常高效，使其成為WES陰性的重要輔助手段。然而，通過對WES數據的挖掘和表型驅動的目標分子檢測更有性價比，減少對全基因組測序的依賴。
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