Nature Genetics | Trios模式的全外顯子捕獲測序揭示疾病新機制

研究背景

腦癱(CP)是影響運動功能的主要神經發育紊亂(NDD)性質的疾病，世界上每1000名兒童中約有2 - 3人受到影響。運動障礙的發作發生在生命的最初幾年，是大腦發育中斷的一種表現。迄今為止，已有5項研究分析了CP病例的基因組拷貝數變異(CNVs)，發現10-31%的病例存在可預測的有害拷貝數變異。在CP病例中已經進行的全外顯子組測序(WES)研究中，最大的一項研究報導了98個非選擇性CP的父母-子女trios中約有14%存在推測的有害變異。這些研究表明了CP中潛在的重要遺傳風險，但對照數據不足限制了可以做出的統計推斷，並且沒有對新的候選基因變異進行功能驗證。在本項研究中，研究者試圖解決這些問題。

研究者利用CP病例正常表型的兄弟姐妹和他們正常表型的父母組成的對照組，對250個CP trios進行了WES測序，其中包括91例既往報導的和159例來自美國、中國和澳大利亞的中心。病例在兩歲時出現症狀。250個家庭群體中，157例 (62.8%)為特發性（未知原因），84例（33.6%）與一個已知環境損害有關，其餘9例（3.6%）無法分類。

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發表時間：2020年10月

第一作者單位：耶魯大學醫學院

影響因子：27.603

摘要

除了常見的環境因素外，基因因素也可能導致腦癱。研究者對250個父母-子代的trios模式（parent–offspring trios）進行了全外顯子組測序，在腦癱病例中觀察到具有破壞性的新生突變的富集。8個基因具有多重破壞性的新生突變，其中兩個基因的突變(TUBA1A 和 CTNNB1)在全基因組範圍內具有顯著性。研究者鑑定了兩種新的單基因病因，FBXO31 和 RHOB，並表明 RHOB 突變增強了活性態Rho效應子結合，而 FBXO31 突變降低了cyclin D水平。候選腦癱風險基因與神經發育障礙基因重疊。通過網絡通路分析，確定了Rho GTPase的富集、細胞外基質、黏附灶和細胞骨架途徑。在果蠅的反向遺傳學篩查中，富集通路中的腦癱風險基因被證明可以調節神經運動功能。研究者估計，14%的病例可歸因於過度的破壞性新生或隱性變異。這些發現為基因介導的腦癱早期神經元連接失調提供了證據。

主要結果

1. 損傷性新發突變（DNMs）在CP隊列中顯著富集，並且反覆損傷性新發突變與已知的和新的CP都有關係。

研究者首先評估了新發突變對CP的貢獻。案例和對照中觀察到的新發突變的數量與泊松分布非常接近，表明新發突變是獨立的概率事件。研究者發現，當集中分析對變異不耐受的基因時，CP病例中損傷性新發突變的富集更加明顯，而對照中沒有任何突變類型的顯著富集（表1）。研究者推測，個體基因可能通過一種從頭開始的機制在CP隊列中反覆出現。通過分析，鑑定到8個基因具有2個以上損傷性新發突變。這些基因中蛋白損傷性新發突變在基因水平的富集，強烈暗示這些基因是真正的CP相關基因。在這8個基因中，ATL1、CTNNB1、SPAST 和 TUBA1A 此前已報導過與人類CP表型相關，本項研究在 RHOB 和 FBXO31 中發現了相同但獨立產生的損傷性新發突變。

2. 在RHOB和FBXO31中鑑定功能獲得性新發突變。

RHOB 編碼一個Rho GTPase，在兩例不相關但表型一致的CP病例中具有兩個相同的新發突變。比較RHOB蛋白的野生型和突變型（p.Ser73Phe）的結構模型，可以發現結合位點的形狀和蛋白的表面電荷都發生了改變。生化分析表明，該變異對GTPase激活蛋白(GAPs)和GDP交換因子(GEFs)的反應均明顯增強，最終導致與Rho效應子rhotekin在活性狀態下的結合增強（圖1）。

圖1：CP相關的RHOB突變體S73F的功能驗證。a. Sanger測序驗證來自F064和F244家族的母親、父親和先證者的新遺傳和變異位置。b. 正常與突變RHOB蛋白的Poisson–boltzmann靜電圖。c. F064（上）和F244（下）的腦部核磁共振圖。d. GAP實驗檢測S73F rHOb 變體中GTP水解特性。e. 在GEF實驗中，S73F rHOb變異體中GTP結合性增強。f. 與GTP結合的rho蛋白與rhotekin蛋白互作實驗，S73F GTP的結合增加了4倍。

3. 研究者還在FBXO31中鑑定到兩個不相關的案例具有相同的新發突變。

Asp334是FBXO31結合位點處的保守殘基。FBXO31可以控制軸突的生長，對發育中的大腦中樹突生長和神經元遷移至關重要。FBXO31 p.Asp334Asn影響cyclin D互作位點, 導致cyclin D降解功能明顯增強。FBXO31的一個純合截斷突變已被報導與ID相關(MIM 615979)。本研究中的兩名患者均表現出痙攣性雙側癱瘓CP，與已有報導的FBXO31中新發突變的表型不同 （圖2）。

圖2：對CP相關的FBXO31變種p.Asp334Asn的功能驗證顯示cyclin D調控發生了改變。a. Sanger測序顯示突變位點。b. 野生型FBX031和p.Asp334Asn變種的Poisson–boltzmann靜電圖。c. Western blot結果顯示FBXO31 p.Asp334Asn突變的患者源性成纖維細胞中cyclin D表達下降。

4. CP與其他NDDs的臨床和遺傳重疊。

臨床上，NDDs經常同時發生。在CP病例中，約45%的CP患者並發ID，約40%的患者伴有癲癇，約7%的患者除CP外還伴有ASD。因此，研究者試圖確定來自於已知NDD風險基因的CP患者中具有新發、X連鎖隱性或常染色體隱性分離的罕見損傷變異體的基因。利用疾病基因網絡工具DisGeNET，確定從文獻和資料庫(包括ClinVar、ClinGen和UniProt65)中檢索到的基因和疾病之間的關聯，發現在CP候選基因和主要NDDs之間有大量的基因重疊。相反，當檢查與神經退行性疾病（阿爾茨海默病）的重疊時，沒有發現富集。共有28.9%的CP風險基因與ID相關基因重疊，11.1%與癲癇相關，6.3%與ASD相關。分析數據表明，CP與其他遺傳性NDDs有顯著的遺傳重疊，表明存在潛在的遺傳基因的多效性和共同發生NDDs的常見病因（圖3）。

圖3：常見NDDs的基因重疊。a. 維恩圖顯示候選CP基因和與其他NDDs相關的基因之間重疊基因的數量. b. 超幾何雙尾試驗發現，CP與其他NDDs重疊顯著，而CP與阿爾茨海默病重疊不顯著。

5. 細胞外基質、細胞基質局部粘連、細胞骨架網絡和Rho GTPase基因與CP高度相關。

研究者鑑定了大量具有預測損傷變異的個體基因，並使用一套工具來無偏倚地發現與CP相關的保守途徑和生物學功能。對439個推測的CP風險基因聚類分析顯示，這些基因間的關聯性大於隨機預測的關聯，表明存在一個包含損傷變異的功能性網絡。研究者使用DAVID、MSigDB和PANTHER對其中的基因進行過表達分析，進行功能注釋和通路表徵，識別了代表富集通路和保守功能的多個基因集。

6. 來自Rho GTPase、細胞骨架和細胞投射通路的基因控制果蠅的神經運動發育。

研究者通過對果蠅進行反向遺傳篩選，獨立評估了over-represented通路成員在正常運動發育中的作用。研究者選擇了具有可獲得的分子特徵等位基因的保守果蠅標準基因。利用雙等位基因狀態下的hypomorphic/LoF等位基因來輔助繪製果蠅檢測中感興趣基因的表型。兩個不符合有害篩選標準的變異基因被納入陰性對照。利用幼蟲的轉向測定法和成蟲的負趨地性/正趨光性測定法總共篩選到22個與運動能力有關的基因（圖4）。

圖4：候選CP風險基因的果蠅同源體LoF突變的運動表型。a. 在AGAP1、SEMA4A 和 TENM1基因突變的幼蟲中，旋轉時間(一種協調運動的測量)增加了。b-j.14天大的果蠅有運動障礙。

參考文獻

SC Jin , SA Lewis , S Bakhtiari, et al. Mutations disrupting neuritogenesis genes confer risk for cerebral palsy. Nat Genet 2020 Oct;52(10):1046-1056.

編者按

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