適合您的實驗——GST pulldown,請到碗裡來

2021-01-14 伯信生物

技術背景與原理

    GST pull-down是一個行之有效的驗證酵母雙雜交系統的體外試驗技術,近年來越來越受到廣大學者的青睞。

基本原理是將靶蛋白-GST（誘餌蛋白 bait）融合蛋白親和固化在穀胱甘肽（GSH）親和樹脂上，作為與目的蛋白親和的支撐物,充當一種「誘餌蛋白」,目的蛋白（捕獲蛋白 prey）溶液過柱,可從中捕獲與之相互作用的「捕獲蛋白」,洗脫結合物後通過SDS-PAGE、Western Blot和MS分析,從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應的目的蛋白。「誘餌蛋白」和「捕獲蛋白」均可通過細胞裂解物、純化的蛋白、表達系統以及體外轉錄翻譯系統等方法獲得。

GST：穀胱甘肽巰基轉移酶(glutathione S-transferase），GSH作為GST的底物與其結合。

如果有純化的天然的誘餌蛋白，可將其用生物素進行標記或偶聯一些其他小的標籤，可實現使用鏈親和素瓊脂糖樹脂進行pull-down實驗。

技術流程圖



技術主要操作

1．GST融合蛋白（誘餌蛋白 bait）表達載體構建（基因一般在2000bp以內）

2．目標蛋白（捕獲蛋白 prey）表達載體構建

3．細胞培養、載體轉染

4．GST融合蛋白表達及純化

5．pull down

6．WB檢測/MS檢測

技術分組

陰性對照組NC組

Input組

GST-bait組

pull down組



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