知無不「研」|一文讀懂 GST pull down

2020-12-03 蛋白質組學技術交流

GST pull down實驗原理和流程利用重組技術將誘餌蛋白與GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通過GST與固相化在磁珠上的GTH（Glutathione）親和結合。因此，當與誘餌蛋白有相互作用的蛋白與此固相複合物混合時就可被吸附而分離。

證明2種已知蛋白間可能存在的相互作用通常採用GST pull down+WB；尋找與已知蛋白發生相互作用的未知蛋白通常採用GST+MS。

蛋白表達預測常用網站

1、蛋白表達之---跨膜區預測http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/TMHMM是由丹麥理工大學生物序列分析中心CBS負責維護。TMHMM使用了最xian進的複雜的隱馬爾可夫模型Hidden Markov Models數學模型來預測跨膜區域。

2、蛋白表達之---無序性分析http://protein.bio.unipd.it/espritz/Espritz是一種新的Web伺服器，用於檢測被認為不包含結構成分的蛋白質區域。這種非結構稱為蛋白質異常。 Espritz使用基於雙向遞歸神經網絡（BRNN）的高效且準確的預測算法。BRNN是基於序列的機器學習算法，已發現對其他結構預測有用。

3、蛋白表達之---信號肽預測http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/

參考案例

案例分享一：Proliferating cell nuclear antigen is protected from degradation by forming a complex with MutT Homolog2.PCNA通過與MTH2結合形成複合物從而避免被降解（肺癌）

GST-MTH2/GST-PCNA融合蛋白與A549細胞總蛋白共孵育A：CoIP驗證MTH2與PCNA互作B：GST pull down驗證MTH2與PCNA互作C、D：GST pull down確認互作區域案例分享二：SET7/9 promotes multiple malignant processes in breast cancer development via RUNX2 activation and is negatively regulated by TRIM21SET7/9通過RUNX2的激活促進乳腺癌發生的多個惡性過程，並被TRIM21負調控

C：CoIP實驗，4株細胞（乳腺癌細胞和正常乳腺細胞），正向和反向驗證。D：SET7/9蛋白全長和截短表達確認互作區域案例分享三：PRMT5-dependent transcriptional repression of c-Myc target genes promotes gastric cancer progressionc-Myc依賴PRMT5抑制其靶基因轉錄促進胃癌發展

A：IF檢測c-Myc與PRMT5共定位B：CoIP驗證c-Myc與PRMT5互作C：GST pull down驗證c-Myc與PRMT5互作D：GST pull down確認互作區域E：通過缺失突變進一步確認互作區域F：通過定點突變進一步確認互作位點

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