該步驟的效率隨不同轉移方法和靶RNA相對分子質量而變化

2020-12-06 紅毛丹小妹

●省去了RNA從凝膠向固相支持物轉移的步驟。該步驟的效率隨不同轉移方法和靶RNA相對分子質量而變化。

●省去了雜交後的洗滌步驟。雜交結合的緊密性與洗滌的效率影響了背景與信號強.度。無論多有技巧的洗滌,幾乎都無法使Northerm雜交所導致的信噪比高於10。

●對RNA降解具有更大的耐受性。由於放射性標記的反義探針通常遠遠短於待測的RNA,所以製備的待測RNA部分降解對核糖核酸酶保護實驗的靈敏度與準確性影響不大。

RNase保護實驗分析方法還有Norther雜交不具備的其他優勢:不需要專用設備,可以同時使用多种放射性標記的探針,足夠敏感到可以檢測總RNA中的低豐度mRNA.核糖核酸酶保護具有很多與核酸酶SI保護分析一樣的優勢。

但是,二者在一些細節上存在不同。在核酸酶S1保護分析方法中,富含AU區域通常被核酸酶S1非特異性切割,而在核糖核酸酶保護分析方法中通常並不被非特異性切割,而且雜交體的末端不再處於被蠶食的危險中(請參閱下頁「核糖核酸酶保護分析中使用的核糖核酸酶")。

此外,核酸酶S1保護分析中所用的放射性標記的探針需要特定的寡核苷酸引物以及單鏈DNA模板。而核糖核酸探針可由帶有噬菌體啟動子的標準質粒轉錄而來(詳見第13章)。

基於上述原因,作為RNA分析的標準方法,核糖核酸酶保護分析在很大程度上取代了核酸酶S1保護分析。測定RNA豐度的方法非常奇怪的是,在20世紀70年代只有一種技術一復性動力學可用, 但是對基因表達測定的精度比現在更高。

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