分子細胞中心等研發出系統性鑑定siRNA脫靶位點新方法

2020-12-04 光明網

12月4日，Molecular Therapy–Nucleic Acids在線發表了中國科學院分子細胞科學卓越創新中心（生物化學與細胞生物學研究所）吳立剛研究組，上海市計劃生育科學研究所李衛華研究組與揚州大學趙雅研究組合作的研究成果Identifying Cleaved and Noncleaved Targets of Small Interfering RNAs and MicroRNAs in Mammalian Cells by SpyCLIP。該研究運用自主研發的SpyCLIP技術，對野生型和切割活性缺失的miRNA/siRNA效應器蛋白AGO2平行進行SpyCLIP建庫測序，在全基因組層面準確、高效地鑑定出siRNA、miRNA的切割活性以及非切割活性作用位點，為降低siRNA藥物的潛在脫靶風險，改進siRNA的設計規則提供了強有力的手段。

2018年8月，美國食品藥品監督管理局批准了siRNA藥物ONPATTRO（patisiran），用於治療遺傳性轉甲狀腺素蛋白（hATTR）介導的澱粉樣變性患者。同時，有多種化學合成的siRNA藥物正處於不同的臨床試驗階段。這些siRNA藥物在體內除了能在on-target位點發揮功能，還會在其他位點產生切割活性的或非切割活性的脫靶效應。如何在進入臨床試驗前在細胞水平提前預判或及時發現siRNA的脫靶效應顯得尤為重要，但是目前對於預測siRNA的脫靶效應尚未有成熟方法，主要採用類似預測miRNA靶標的方法——根據siRNA的seed 區域（第2-8位鹼基）進行預測。然而，siRNA的2-8序列僅為7個鹼基，任何一條siRNA均會被預測發現成百上千個可能的靶位點，因而無法實際應用。因此，亟須一種可在全基因組層面上準確、高效鑑定siRNA脫靶位點的新策略。

研究人員運用自主研發的SpyCLIP技術，結合野生型和切割活性缺失的miRNA/siRNA效應器蛋白AGO2，平行地獲取上述兩種AGO2在siRNA的指導下所結合的所有靶標序列。被野生型AGO2-siRNA所結合的有效和脫靶靶標，其轉錄本通常迅速降解，難以在SpyCLIP文庫中得到富集；而被突變型AGO2-siRNA所結合的有效和脫靶靶標，其轉錄本由於突變體AGO2僅能結合而無法發揮切割功能，從而可以在SpyCLIP文庫中得到富集。通過比對上述兩種AGO2-siRNA的靶標結合圖譜，研究人員在全基因組層面上鑑定到所轉入siRNA的脫靶位點，並分類為切割活性和非切割活性兩大類，其轉錄本的抑制效率和與siRNA的配對規則具有顯著差異。研究發現，相比於非切割活性的位點，受切割活性調控的脫靶位點具有更高的抑制效率。此外，與siRNA並非接近完全互補配對的轉錄本，也能夠受到AGO2的切割調控。這些新發現對於未來siRNA藥物研發如何最大化避免脫靶效應具有重要的參考價值。

分子細胞卓越中心研究員吳立剛、上海市計劃生育科學研究所研究員李衛華和揚州大學副研究員趙雅為論文的共同通訊作者，博士研究生張堯和碩士研究生滕怡蘭為論文的共同第一作者。研究工作得到國家自然科學基金委、科技部、中科院、上海市科學技術委員會和江蘇省科技廳的支持。

運用SpyCLIP技術平行捕獲野生型和突變型AGO2-siRNA的靶標結合圖譜，獲得全基因組層面上的脫靶位點信息

來源： 分子細胞科學卓越創新中心

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