基因編輯技術存在的脫靶效應是影響其能否廣泛應用的主要限制因素。
近日，《自然—方法學》在線發表中國農業科學院深圳基因組研究所、中科院神經科學研究所與中科院馬普計算生物學夥伴研究所合作的最新成果。
他們根據蛋白結構預測了基因編輯過程中決定脫靶效應的重要胺基酸，並在不影響催化活性的情況下突變相應胺基酸，最終得到了顯著降低基因編輯脫靶效應的單鹼基編輯工具。
GOTI技術的延伸
2019年3月，該團隊曾在《科學》發布用於檢測基因編輯技術脫靶率的GOTI技術。
論文共同通訊作者、中國農業科學院深圳基因組研究所研究員左二偉告訴《中國科學報》，這項最新成果即為基於GOTI技術探索解決單鹼基編輯器脫靶效應的方法。
目前，以CRISPR/Cas9 系統為核心的基因編輯工具被廣泛應用於造血幹細胞、神經細胞等醫學研究領域。
「傳統的CRISPR/Cas9 系統要切斷DNA雙鏈，這給基因編輯結果帶來了一定的不確定性。」
左二偉說，其衍生工具——單鹼基編輯技術可以在不切斷DNA雙鏈的情況下實現單核苷酸的定向突變。
「這為治療單鹼基突變引起的遺傳性疾病帶來了希望。」
GOTI技術是全新一代基因編輯脫靶檢測技術，該技術在靈敏性、準確性和適用範圍上遠超之前的脫靶檢測技術。
「有了GOTI技術以後才能準確評價基因編輯技術的安全性。」
論文共同通訊作者、中科院上海神經科學研究所研究員楊輝告訴《中國科學報》，在此基礎上才能有目的地去改進已有的單鹼基編輯工具或開發新的編輯工具。
管住任性的脫氨酶
單鹼基編輯工具是人類根據蛋白工程設計、以胺基酸序列構成的蛋白質分子，該系統由脫氨酶和nCas9等組件構成融合蛋白發揮功能。
左二偉介紹，利用GOTI技術，他們發現胞嘧啶脫氨酶單鹼基編輯技術（CBE）的脫靶是由胞嘧啶脫氨酶造成的。
「脫氨酶在編輯工具中扮演著催化的角色。它本來應該在sgRNA帶領下，按照鹼基配對規律，使Cas9蛋白結合到基因組相應位置上，對單鹼基進行轉化。但脫氨酶本身具有ssDNA和RNA結合能力，它會帶著Cas9蛋白在任意『喜歡』的位點引發鹼基突變。」左二偉說，這是一種完全隨機無法預測的脫靶效應。
找到了CBE脫靶的原因，該團隊即開始著手改進單鹼基編輯工具。
論文共同通訊作者、中科院馬普計算生物學夥伴研究所研究員李亦學在接受《中國科學報》採訪時說，在脫靶效應檢測中，計算生物學能提供詳細的計算方法和模式，從而通過分析實驗數據快速獲得結論，分析脫靶的程度和危害。
而在改進單鹼基編輯工具時，計算生物學則發揮了強大的運算能力：利用高通量的生物信息學手段來篩選脫氨酶改造的目的位點。
「我們利用同源序列比對的方法，預測了結構未知的脫氨酶與ssDNA或RNA結合的區域，並在這個區域的重要胺基酸上引入了特定的突變。通過改變蛋白構象，消除了脫氨酶與ssDNA或RNA的結合能力。」
論文共同第一作者、中科院分子細胞科學卓越創新中心博士孫怡迪告訴《中國科學報》。
研究人員一共構建了23個CBE突變體，並全面檢測了突變體是否存在全基因範圍內的脫靶，發現其中4個突變體不會影響基因編輯效率，還能夠降低隨機脫靶效應。
「我們優化了上述CBE突變體，增加標籤和核定位序列，在高保真的情況下，顯著提高了基因編輯效率，從而使其成為既安全又高效的新的基因編輯工具YE1-BE3-FNLS。」
楊輝說，這一新工具有望應用於遺傳疾病基因治療，推動基因編輯臨床化應用。
實現商業化還有很長的路
「我們希望GOTI技術能成為用於檢測基因編輯脫靶的金標準。」
楊輝說，無論是基因編輯技術的科學研究，還是遺傳病的基因療法，都應該用高效準確的方法去評估其安全性，也就是脫靶效應。
「在實驗室階段還是比較容易實現GOTI技術的。但應用於臨床，還有很多優化和降低成本的工作要做。真正實現商業化，還有很長的一段路要走。」李亦學說。
左二偉認為，新的單鹼基編輯工具對於基因治療中常用的載體腺相關病毒來說，「體積有點大」，這是未來需要改進的地方。
「這項技術需要直接消化掉小鼠整個發育良好的胚胎，這種操作很難用在人的身上。」
孫怡迪說，新的基因編輯技術如何實現無創傷檢測，是一件值得思考的事。
楊輝則強調，目前對脫靶效應的檢測、對單鹼基編輯工具的改進等，都是在實驗室完成的，「已經解決了基因編輯技術的安全性和有效性問題」，而基因治療的安全性和有效性尚待動物實驗和臨床試驗進一步驗證。