小麥總RNA的提取實驗

2021-01-12 生物谷

實驗步驟

實驗原理

1所有容器高溫滅菌兩次，DEPC高溫滅菌，所有的試劑用DEPC配製，高溫滅菌。 去除RNA酶（外源）的影響。 高溫滅菌兩次可以破壞RNA酶的復性過程.雖然RNA酶極易復性，但兩次連續的高溫會打亂它的復性歷程，從而使RNA酶失活。 DEPC是RNA酶的非競爭性抑制劑。DEPC可以與RNA酶的活性中心的組氨酸咪脞環上的N結合，從而使RNA酶失活。 因為DEPC能與RNA的N結合，從而修飾RNA，所以，必須將DEPC最終除去。在高溫滅菌時，DEPC因高溫分解而揮發。（UV也能修飾RNA，實驗時應避免。） DEPC滅菌後稱為DEPC水，它是不含DEPC的。 實驗過程中要勤換手套，必要時要在超淨工作檯中進行。 2在一滅菌2mL管中加入: 5mol/L異硫氰酸胍 0.7mL 苯酚 0.4mL 2mol/L NaAc(pH4.0) 0.1mL 必須提前準備好變性劑。 異硫氰酸胍可以變性RNA酶，也可以破細胞。本試驗不可以用酶法破細胞。因為蛋白酶K的適合的條件也可以是RNA酶有活性。 NaAc酸性可以使DNA在有機相（酚相）中，而在鹼性條件下，DNA和RNA都在水相中，無法分離，所以，Ph在本是嚴重很關鍵。 苯酚用於抽提DNA和蛋白質。 3稱取0.2g小麥黃化苗的葉片，迅速在液氮中研磨成粉末,轉入已準備好的離心管中。 劇烈震蕩。 低溫防止內源性RNA酶降解RNA。 劇烈震蕩是使所有的細胞散開，浸在變性劑中。低溫的細胞在相對來說高溫的液體中是會形成一團，這樣就會使內部的RNA沒有水解RNA的機會。 小麥的黃化苗因為沒有光合作用，所以含糖少，易於抽提。 4混勻,冰浴30min。

54℃,12000rpm,10min。 6上清至另一離心管中 加0.4Ml氯仿，劇烈震蕩。冰浴放置5min。 去脂類。 740C,12000rpm,10min。 8棄有機相（下層） 加入0.4Ml氯仿和0.4Ml酚。室溫放置5min。 去脂類和蛋白質。 940C,12000rpm,10min 棄有機相，加入等體積異丙醇。-200C放置1h。 去糖，脫水。因為體系高鹽（2mol/L NaAc），所以可以使RNA沉澱。 1040C,12000rpm,10min 沉澱用70%乙醇洗兩次。 因為提出的量很少，可能不可見，所以離心是要有方向標記。 11室溫稍乾燥。 RNA是非常不好溶解的，所以只能稍乾燥。若不溶解是因為有太多的糖的殘餘。 12沉澱加20uLDEPC水溶解(-200C保存) DEPC水中不含RNA酶。 13RNA電泳： 1％瓊脂糖膠20 mL 8μL樣品 1μL樣品緩衝液 1μLSYBR 100V恆壓電泳 測OD260和OD260／OD280

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