RNA-XPress 快速提取試劑

RNA-XPress 快速提取試劑

RNA-XPress Reagent

簡介

RNA-XPress為即用型，用於從各種樣品中快速分離RNA。獲得的RNA可用於下遊的Northern Blot、mRNA分離、體外翻譯、RT-PCR、核酶保護實驗等

原理

RNA-Xpress為硫氰酸胍和苯酚的單相混合液，能有效溶解RNA。加入氯仿並離心後，溶液分為3相，水相含RNA，中間相含DNA，有機相含蛋白質。1ml RNA-Xpress可用於50-100 mg組織、5-10×10 6細胞、或10 cm2平皿單細胞層。該方法對Chomczynski和Sacchi發明的RNA一步分離法進行了改進，可在1小時內完成。

樣本類型

人、動物、植物、細菌、酵母、病毒

操作流程

A) 樣本製備

1a. 組織：採用勻漿器將樣品和RNA-Xpress試劑充分混勻， 1ml RNA-Xpress試劑適合50-100mg組織

1b. 單細胞層: 在平皿中直接裂解細胞，10 cm2平皿單細胞層加1mlRNA-Xpress，用移液器吹打。平皿要求為玻璃皿，不能為塑料皿。

1c. 懸浮細胞：最多離心1×107細胞，4℃，300 × g，5min。棄上清，加1mlRNA-Xpress試劑，反覆吹打。（動物細胞、細菌、酵母、植物細胞數量均同上）

注意：

1. 細胞用RNA-Xpress勻漿或裂解後，在-70℃最多放1個月時間。

2. 如果下列成分含量較高，可能需要額外的操作步驟，具體參考原版說明書：脂肪、蛋白、多糖和細胞外基質（如肌肉）。

B）相分離

將均質化的樣品在室溫（15-25℃）孵育5分鐘，使核蛋白複合物完全解離。

每毫升RNA-Xpress試劑加入200μl氯仿。蓋緊樣品，劇烈搖動15秒，在室溫（15-25℃）下靜置10分鐘。將得到的混合液以12,000×g（≈13,000rpm）在4°C時離心15分鐘。離心後，混合液分成底部深紅色有機相（含蛋白質），中間相（含DNA）和無色含有RNA的上層水相。

注意：

用於相分離的氯仿不應含有異戊醇和其他添加劑。

C）RNA沉澱

將含有RNA的水相轉移到新管中並加入500μl異丙醇。讓樣品在室溫（15-25℃）下靜置5-10分鐘。 在4℃下 以12,000×g（≈13,000rpm）離心10分鐘。通常在離心前不可見的RNA沉澱，在管底或側面形成膠質狀沉澱。

D）RNA清洗

去除上清液而勿碰到沉澱。加入1ml（至少）75％乙醇清洗RNA沉澱。渦旋樣品，然後在4℃下以 7500 x g（≈10,500rpm）離心5分鐘

E）RNA復溶

去除上清液而勿碰到沉澱。風乾RNA沉澱5-10min。不要讓RNA完全乾燥。加50 l無RNA酶水溶解RNA。為方便溶解，可用移液器反覆吹打。在55-60°C孵育10-15分鐘。提取的RNA可在-80°C保存。避免反覆凍融。

RNA濃度、產率和純度

製備的RNA不含DNA和蛋白質。RNA可測260nm、280nm、320nm吸光度。OD260應在0.1~1.0，OD320用於背景校正。OD260=1對應約40 g/ml RNA。純度=OD260/ODA 280，應≥1.7。

組織的RNA產率（ g RNA/mg 組織）：肝臟、脾臟（4-10 g）、腎臟 (2-4 g)、骨骼肌、大腦 （1-1.5 g）、胎盤（1-4 g）

培養細胞的RNA產率：上皮細胞(6-15 g)、成纖維細胞(3-7 g)

存儲條件

15--25°C

參考文獻

1. Chomczynski P., BioTechniques 15, 532-537(1993).

2. Chomczynski P. and Sacchi,N., Anal .Biochem.,162,156-159(1987).