實驗 質粒DNA的微量製備

2020-12-06 小客生活

一、實驗目的

1 ．了解質粒的特性及其在分子生物學研究中的作用；

2 ．掌握鹼裂解法分離、純化質粒DNA的方法。

二、基本原理

質粒(Plasmid)是一種染色體外的穩定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、閉環的DNA分子，並以超螺旋狀態存在於宿主細胞中。

質粒具有自主複製和轉錄能力，能在子代細胞中保持恆定的拷貝數，並表達所攜帶的遺傳信息。

質粒的不相容性：利用同一複製系統的不同質粒不能在同一宿主細胞中共同存在。

高鹼：

細菌的細胞膜破裂，內容物釋放。

染色體線性DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性。

質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環狀的兩條互補鏈不會完全分離。

高酸中和至中性：

變性的染色體DNA與變性的蛋白質以及細胞碎片凝聚成網絡狀大分子不溶性沉澱物。

質粒DNA又恢復天然構型，溶解在上清液中。

純化：

RNA酶消化除去RNA，並用酚抽提法除去殘留的蛋白質。

三、試劑及器材

1 ．試劑

溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl組成 (保護、緩衝)

①葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,減少抽提過程中的 機械剪切作用,防止破壞質粒 (保護作用)。

②EDTA 的作用是絡合掉鎂等二價金屬離子, 防止DNA酶對質粒分子的降解作用（保護作用）。

③Tris-HCl 使溶菌液維持溶菌作用的最適PH範圍（緩衝作用）。

溶液II：由SDS（十二烷基硫酸鈉）與 NaOH 組成(裂解、變性)。

①SDS的作用是解聚核蛋白並與蛋白質分子結合使之變性（裂解細胞和蛋白質變性作用）。

②NaOH（PH>12）的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性（DNA變性作用）。

溶液III：HAc和 KAc組成的高鹽溶液 (復性，分離)。

①HAc溶液能中和溶液Ⅱ的鹼性，使染色體DNA 變性而發生纏繞，並使質粒DNA復性。

②KAc會與SDS形成溶解度很低的鹽，並與蛋白質形成沉澱而除去；溶液中的DNA也會與蛋白質-SDS複合物纏繞成大分子而與小分子質粒DNA分離。

2 ．材料

攜帶PET28a質粒（卡那黴素抗性）的大腸桿菌DH5α。

PET28a質粒
大腸桿菌

3 ．器材

試管，Eppendorf管，移液器，恆溫振蕩器，高速臺式離心機，冰塊，接種環，旋渦混合器。

四、操作步驟

1．培養細菌擴增質粒

將攜帶PET28a質粒的大腸桿菌接種於含卡那黴素的LB液體培養基中，37℃搖床培養16h左右。

2．收集菌體和裂解細菌

1. 取2ml菌液室溫10000 rpm離心1min。

2. 去上清，加250l溶液P1（含RNase A），渦漩振蕩器震蕩至菌體完全懸浮。

3. 加入250l溶液P2，溫和顛倒離心管4~6次，獲得澄清的裂解液。最好室溫孵育2min，劇烈混合會使剪切染色體DNA，降低質粒純度。

4. 加350l溶液P3，溫和顛倒數次混合，至出現白色絮狀沉澱。

5. 室溫13000 rpm離心10min。

6. 特別小心吸取上清，移至潔淨的裝配好容積2ml離心管的吸收柱中。要保證沒有吸入沉澱和細胞碎片。室溫10000 rpm離心1min，至裂解物完全通過吸收柱。

7. 棄濾過液，加600l 溶液PW2，10000 rpm離心1min。

8. 棄濾過液，將吸收柱置於原收集管中，13000 rpm離心1min，確保乙醇被去除（乙醇會影響下面的步驟）。

9. 將吸收柱放入乾淨1.5ml離心管，加30l無菌去離子水或EB緩衝液在濾膜上，靜置2min，13000 rpm離心1min。

五、注意事項

1．細菌培養過程要求無菌操作。細菌培養液、配試劑用的蒸餾水、試管和Eppendorf離心管等有關用具和某些試劑經高壓滅菌處理。

2．製備質粒的過程中，所有操作必須緩和，不要劇烈振蕩，以避免機械剪切力對DNA的斷裂作用。

#生物學#

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