載體構建(vector construction)是分子生物學研究常用的手段之一。目的是尋找一種能進入細胞、在裝載了外來的DNA片段後仍能照樣複製的運載體，將DNA分子運送到受體細胞中去。理想的運載體是質粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工構建的質粒作為載體。載體構建即是構建含外源DNA的質粒。本文主要為大家介紹質粒圖譜的閱讀及通過同源重組構建質粒的方法：
構建質粒，學習閱讀質粒圖譜是必不可少的一環，下圖為實驗室常用的一種質粒：
（1）箭頭：
大多數質粒都會有箭頭，箭頭有兩種解釋。一種是轉錄方向，轉錄方向主要是由啟動子開始的一個大箭頭，是啟動子啟動序列的順序。另一種是複製起始位點的方向，複製起始位點就是該質粒在大腸桿菌等細菌或真菌中DNA複製的一個方向。我們還需要提到的是F1啟動子（圖上的f1 ori）代表的是噬菌體的複製起始方向，只能複製出單鏈的DNA，但是可以用來測序。看懂轉錄的方向，這樣就方便設計插入片段的位置和方向性。
（2）ori：DNA 複製起始位點，大腸桿菌中一般為pUC類。
（3）P:
一般是代表啟動子，這個質粒上用的是一個CMV啟動子，來啟動後面的表達蛋白。常見的啟動子有：CMV、EF1（啟動長片段），H1、U6（啟動短片段，比如shRNA），35S、2×35S（植物用）。
（4）抗性基因：
最常見的是：Amp（氨苄青黴素，常用）、Kan（卡那黴素，常用）、Tet（四環素，tet on/tet of）、Cmr（氯黴素，某些酵母表達質粒）、SM（鏈黴素）、Hyg（潮黴素，農桿菌裡常用的），看清楚抗性，才能不用錯，否則無法長出單克隆菌落。
（5）pA：轉錄終止位點poly A。
（6）報告基因：
通常會有一兩個蛋白，被用作報告基因，比如常見的copGFP（綠色螢光蛋白），Puro（嘌呤黴素），Lacz（乳糖操縱子）等等。和抗性基因不同，這樣的報告基因，並不是為了在大腸桿菌擴增質粒的過程中起作用的。而是在質粒轉入表達體系後起到作用的，基本上就是為了顯示過表達或是敲減的基因是否正常運作。有的報告基因會融合在蛋白中表達，有的會另外用一個獨立的啟動子進行表達（比如shRNA的質粒中）。
根據瓊脂糖凝膠電泳圖可判斷出質粒的品質，如下圖所示，從上而下分別為質粒的三種形式：OC：開環狀DNA；L：線狀DNA；SC：超螺旋DNA。隨著技術的不斷改進，我們在現今提取質粒的實驗中，最常見的是超螺旋和開環DNA這兩條帶。因用質粒轉染真核細胞時，超螺旋的質粒效率最高，所以判斷質粒好壞的一個指標就是超螺旋質粒在質粒中的含量。
當DNA雙鏈由於特定內因或外因形成了斷裂，體內的修復系統會參與修復損傷的DNA，目前已知有兩種機制參與DNA雙鏈斷裂的修復，一種是非同源性末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)修復機制，另一種是同源重組(homologous recombination，HR)修復機制。
利用HRR思路，人們開發出了許多基因編輯手段，如：Cre/loxP重組酶系統、CRISPR/Cas基因敲入、同源重組構建質粒。下文為大家介紹同源重組構建質粒的方法：
（1）線性化載體的製備
用於重組反應的克隆載體必須為線性化載體。該線性化載體可通過內切酶消化環狀載體獲得，也可由反向PCR擴增環狀載體獲得。不同方式製備的線性化克隆載體的使用方式可查閱下表。
（2）插入片段引物設計
結合設計引物的總原則，通過在引物5』 端引入線性化克隆載體末端同源序列，使得插入片段擴增產物5』和3』最末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對應的完全一致的序列(15 bp～20 bp)，對引物進行設計。
（3）實驗步驟
進行重組反應
於冰水浴中配製如下反應體系（表2）。體系配製完成後，用移液器上下輕輕吹打幾次混勻各組分，避免產生氣泡。置於37℃反應30 min。待反應完成後，立即將反應管置於冰水浴中冷卻5 min。之後，反應產物可直接進行轉化；也可儲存於-20℃，待需要時解凍轉化。
轉化塗板
取20 μl冷卻反應液，加入到200 μl感受態細胞中，輕彈管壁數下混勻，在冰上放置30 min。 42℃熱激45～90秒，冰水浴孵育2 min。加入900 μl SOC或LB培養基，37℃孵育10 min充分復甦。37℃搖菌45 min。取100 μl菌液均勻塗布在含有適當抗生素的平板上。將平板倒置，於37℃過夜培養。
克隆鑑定
最方便快捷的方法是菌落PCR。用無菌的槍頭或牙籤將單個菌落挑至20～50 μl LB培養基中混勻，直接取1 μl作為PCR模板。將PCR陽性菌落的剩餘菌液接種至含有適當抗生素的LB培養基中培養過夜，提取質粒做後續的鑑定。
注意事項：
（1）設計引物時要遵循引物設計的基本原則，注意引物的長度、Tm值、5』端及3』端等要求，避免出現條帶不清晰或出現雜帶等現象，影響後續實驗。
（2）在引物設計時可選用CE Design軟體進行設計，功能多樣，操作簡便。
（3）配置體系時，如果不慎將液體粘在管壁，可通過短暫離心使其沉入管底。
（4）用移液槍上下吹勻各組分時，請勿劇烈震蕩或者渦旋震蕩儀混勻，避免各成分失活。
（5）克隆鑑定時，至少用一條通用測序引物進行菌落PCR，避免PCR假陽性的產生。